细胞衰老与肾移植

大光

细胞衰老与肾移植
谢轲楠 综述  孙启全 审校
作者单位：南京军区南京总医院全军肾脏病研究所
来源：《肾脏病与透析肾移植杂志》2012年2月第21卷第1期


[摘要]细胞衰老是生物老化进程的重要组成部分。越来越多的研究表明，细胞衰老的两条主要信号通路(p53和p16途径)在肾移植后肾脏病变的发生、发展及预测移植器官预后等方面，起到重要作用。本文简单总结目前关于细胞衰老分子机制方面的研究观点，并就其在肾移植领域的相关研究做一简单综述。


    细胞衰老是生物界的普遍现象，对多细胞有机体来说，由受精卵分裂、分化出执行不同功能的细胞，这些细胞从产生开始，就处在衰老的过程中，直到凋亡。细胞衰老是一个复杂的生理过程，最初在肿瘤和慢性疾病领域被关注。在肾移植，人们对细胞衰老现象的研究源于移植肾慢性化病变(肾小管萎缩/间质纤维化)的研究。随着认识逐渐加深，目前发现移植肾排斥反应、慢性移植肾功能不全都与细胞衰老密切相关。细胞衰老的指标甚至可能用以推断移植器官的预后。本文就细胞衰老在肾移植方面的研究进展作一简述。

相关定义

    我们通常所说的“年龄”指的是生物体从出生算起所经历的时间。而细胞衰老又称复制衰老，或复制停止，是最初在体外实验中提出来的细胞水平的概念，指细胞在信号转导作用下不可逆地脱离细胞周期并丧失增生能力后进入的一种相对稳定的状态。细胞衰老是生物体中普遍存在的一种不可逆的生长停滞的现象，是器官衰老的基础，细胞衰老可能对器官造成以下影响：器官中衰老的细胞数比例较高，可能影响其行使正常的功能和维持器官的完整性，降低器官对抗压力和适应环境改变的能力，表现出器官功能不全；细胞衰老影响器官损伤的正常修复过程，导致损伤相关的炎症状态持续，推进纤维化的进展。所以，目前普遍认为细胞衰老与生理及病理情况下器官功能变化密切相关。

细胞衰老的信号途径

    细胞衰老的过程可能由多种刺激或应激原触发。对于细胞衰老的认识，源于20世纪60年代Hayflick和Moorhead对体外培养细胞的观察(即著名的端粒学说)，1961年Leonard Hayflick发现，端粒的长度随着细胞复制周期的增加而逐渐缩短(被形象地称为“端粒损耗”)，当端粒缩短至一定长度，即在有限的复制周期之后，细胞进入复制停滞或死亡。由此可见，细胞衰老与端粒缩短、端粒功能障碍、DNA损伤(如由于X线、氧化应激、紫外线辐射等造成)、致癌基因等产生的异常丝裂信号及非遗传毒性应激(如表观遗传变异)等多种应激原相关。

    尽管触发细胞衰老的应激原可能多种多样，但细胞衰老的主要信号途径只有两条(图1)：ARF-p53-p21信号通路(与端粒相关)和p16-pRb信号通路(与端粒无关)。这两条通路彼此关联、相互影响，但分别都能独立引发衰老过程。由体外实验提出的端粒学说发展至今，细胞衰老的现象终于在近年广泛开展的体内实验中得以证实它的存在与重要作用。

图1细胞衰老的两条信号途径

    端粒缩短和p53途径  端粒是位于染色体末端的DNA-蛋白复合物，其DNA序列由生物特异性的简单串联重复序列组成(在人类，由TTAGGG串联重复序列组成)，端粒具有维持染色体结构完整和保证染色体末端被正确复制的作用。端粒使正常染色体端部间不发生融合，并可补偿滞后链5'末端在消除RNA引物后造成的空缺，维持染色体完整、稳定并行使其正常功能。端粒DNA由端粒酶合成，端粒酶是一种逆转录酶，以自身RNA为模板，合成端粒重复序列，通过在染色体末端直接添加端粒的DNA重复序列从而阻止端粒缩短。由于人类大多数体细胞并不表达端粒酶，因此端粒随着细胞不断分裂而逐渐缩短。当端粒缩短至一定长度(达“Hayflick极限”)，将触发由多种蛋白激酶(如ATM和CHK2)、衔接蛋白(如53BP1和MDC1)和染色质修饰因子(如γH2AX)参与经典的DNA损伤反应，使细胞停止分裂，导致细胞衰老与死亡。

    端粒缩短通过p53磷酸化作用激活细胞衰老的p53途径，并伴有p21(也称CDKN1A、p21Cip1，Waf1或SDI1)表达，导致细胞周期停止。p53、p21基因分别定位于17p13.1和6p21.2，编码抑癌蛋白p53和细胞周期蛋白抑制因子p21。p53是一种应激蛋白，在细胞受到刺激后迅速上调，激活p21基因，进而抑制细胞周期蛋白A(cyclinA)的活性，阻止视网膜母细胞瘤蛋白(RB蛋白)的磷酸化和细胞周期的进行。除端粒缩短外，p53途径也可能参与或引发由DNA损伤引起的衰老现象。生理情况下端粒缩短是伴随体细胞分裂而出现的不可避免的现象，然而环境因素或类似于端粒酶变异等基因突变也参与影响端粒长度。

    目前实体器官移植是否加速端粒缩短的问题尚存争议。观察肾小管上皮细胞凋亡现象发现，移植可能加速细胞周期。在肾移植初期，对于增生细胞核抗原(PCNA)的观察发现，移植后迅速出现上皮细胞再生增加，并且与缺血时间相关。随着再灌注时间的推迟(即缺血时间的延长)，PCNA的表达增加。一般情况下，即使是生长因子刺激，肾小管细胞也不易增生。然而缺血时，残存的肾小管细胞能够重新进入细胞周期，开始复制，从而替代损伤的细胞。尽管尚需进一步的研究证实，但可以推断，这些上皮细胞复制周期的增加，很可能增加端粒损耗。移植手术相关的缺血再灌注损伤引起细胞复制周期的增加和端粒的损耗的具体机制，尚需进一步的研究。

    Koppelstaetter等观察到，移植术前患者肾组织标本中的端粒长度，与术后第12个月移植肾功能恶化(以血清肌酐水平反映)独立相关。在这项研究中，肾移植术前p21的表达水平与供者年龄及术后移植肾功能恶化均无明确相关性。在另一项研究中，Melk等发现，供者年龄(即在纪年意义上肾脏的年龄)和p21及p53表达水平均无明确相关性，相似地，ARF蛋白与肾脏的年龄也无显示出明确相关性。然而，p53的表达和组织学上观察到的肾小管萎缩、肾小球硬化却有显著关系，这种关系的产生机制，可能与肾脏的年龄以及与肾小管萎缩相关的ARF蛋白的表达无关。具体机制目前尚未阐明，但可以假设，p53信号通路并不是造成老年肾脏(即来源于高龄供者的肾脏)组织上慢性化病变的主要原因，可能其他的信号通路(如p16信号通路)起到更为关键的作用。关于老年肾脏端粒缩短和p53信号通路介导的衰老现象和纤维化过程，尚需进一步研究。

    关于环孢素的研究有一个有趣的发现是，环孢素可能由于产生活性氧簇从而诱发端粒缩短、激活p53通路、增加肾小管上皮细胞p21的表达。使用环孢素治疗后，细胞停止在G0/G1期，可见在存活细胞总数不变的情况下，存在环孢素剂量依赖性的DNA合成减少。环孢素并不能诱导凋亡，这提示端粒缩短介导的细胞周期停滞，仅能造成衰老现象，而不能启动程序性的细胞死亡。环孢素不仅激活p53-p21信号通路，还同时增加p16的表达，这是否在环孢素肾毒性的发生和进展中起到作用尚不清楚。

    Chkhotua等对14例正常人及9例移植肾慢性排斥反应的肾组织标本的研究表明，移植术后急性排斥反应的次数与端粒长度缩短相关。然而，考虑到选择偏倚可能影响观察结果，且该研究病例数太少而不能得到有足够说服力的结论。在之前的一项动物研究中发现，移植术后60d，同基因移植物和异基因移植物端粒缩短程度相似，并且相对于供受者的遗传背景差异，端粒缩短与缺血-再灌注的时间反而关系更为显著，而非排斥反应。在这项研究中，仅在发生慢性排斥反应的动物模型中可见β半乳糖苷酶(SA-βgal，细胞衰老的一个生物学标志物)表达增加。

    p16-pRB途径  p16蛋白与细胞周期蛋白D(cyclinD)竞争性结合细胞周期蛋白依赖性激酶(cyclin dependent kinase 4/6，CDK4/CDK6)，抑制CDK4/CDK6的催化活性，从而抑制RB蛋白磷酸化，减少延伸因子E2F释放，使细胞分裂不能通过G1-S期限制点而被阻滞于G1期。

    引发DNA损伤反应的信号同时激活p16-pRB通路，尤其是在上皮细胞，尽管端粒功能障碍也能诱发p16表达，但p16的表达反映最初的环境应激，这种非端粒依赖的细胞衰老途径近期被命名为“STASIS(stress and aberrant signaling-induced senescence)”。

    p16蛋白由CDKN2A编码。CDKN2A也编码ARF蛋白，而ARF蛋白是p53信号通路的重要的组成部分。由此可见，p53信号通路和p16-pRB信号通路相互影响，且两者存在反作用。尽管如此，两条信号通路均可独立抑制细胞周期。由于大多数衰老的细胞都表达p16，p16目前被认为可用于识别衰老的细胞。

    与p16信号通路激活相关的细胞衰老现象在肾移植术后起到重要作用。在小鼠中观察到，p16的表达随着年龄的增长而增加(但不伴端粒缩短，因为小鼠不存在端粒缩短的现象)，移植年老的肾脏，可见p16表达迅速增加，并且更明显地表现出术后组织学上的慢性化改变(包括肾小管基膜皱缩)。与之不同的是，年轻的动物移植年老的肾脏之后仅有轻度的p16表达增加，这说明，在高龄的动物，既存在较高的p16基础水平，并且p16的水平在移植后相对快速地增加。同时发现，高龄的动物肾移植后Ki-67的表达明显减少，Ki-67被认为是一个反映增生和上皮细胞再生能力的标志。然而这些研究仅针对小鼠，目前尚缺乏针对人类的相关研究。

    Koppelstaetter等发现患者移植术前肾组织标本中CDKN2A表达的水平被认为是与供者年龄和术后移植肾功能明确相关的重要因素，CDKN2A同时与供者年龄和术后移植物功能相关，而端粒长短并未表现出相关性。因此，移植术前肾组织标本的CDKN2A水平是较实际年龄更好的预测术后6月及12月移植肾功能的指标。

    在术后组织学表现为间质纤维化和肾小管萎缩的移植肾脏，根据皮质肾小管表达p16水平所计算出的预期年龄要明显大于它们的实际年龄。这提示存在p16衰老通路的上调，或“加速性衰老”。也有其他的研究描述这种p16表达上调和组织间质纤维化/肾小管萎缩相关的现象，并认为其与移植肾功能衰退相关。术后器官功能稳定的移植肾脏，根据p16表达水平所计算出的预期年龄与实际年龄相符，而在功能减退、间质纤维化/肾小管萎缩的移植肾，由p16水平计算所得的预期年龄要远远高于肾脏的实际年龄。

    肾移植术后p16表达增加的原因尚不清楚，同基因移植后p16仍维持于基线水平，而同种异基因移植后p16表达明显增加，提示异基因供受者间的排斥反应可能影响移植物p16的表达。相似地，小鼠同种异基因移植与p16表达上调相关。然而有趣的是，SA-βgal表达的增加仅与慢性排斥反应相关，提示SA-βgal可能在纤维化的进展中起到作用，而p16表达并没有与纤维化明确相关的证据。

    非免疫因素也可能在肾移植术后p16表达增加起到一定作用。前面已经提到，一个相对明确的例子就是长期使用环孢素。众所周知，长期使用环孢素会造成慢性组织学损伤，然而这种现象可能存在一个多因素参与的复杂机制。对于体外培养的细胞的研究认为，其机制与端粒缩短、p53信号通路及p16信号通路均有关系。

    有对于小鼠的研究发现，肾组织p16的表达与再灌注持续时间相关，但与缺血时间延长无明确相关性。这种现象是否存在于人类临床肾移植尚不清楚。有趣的是，一项关于人类的研究发现，冷缺血时间与p16表达并无关系。

    与关于动物的研究不同，对于人类的研究目前还非常有限，尚不能明确p16表达与移植肾功能损伤是否存在因果关系。并且目前难以评价p16的表达与人体衰老、异基因排斥反应、缺血-再灌注损伤、免疫抑制剂肾毒性及其他肾移植术后可能存在的病变，对于移植肾功能衰退的进程可能的相互作用及共同影响。Melk等在此项领域中做了许多贡献性的工作，证明在术后肾功能减退的移植肾脏中，p16表达增加。他的研究支持损伤的进程与衰老相关，但不能明确它们之间是否为因果关系，以及存在怎样的因果关系：加速的衰老进程可能引起损伤，抑或损伤可能加速衰老的进程，或二者同时存在？研究发现，术后移植肾功能不全的患者肾组织中除肾小管萎缩/间质纤维化的区域p16的表达增加，慢性化病变不明显的区域p16表达也增加，这说明p16并不是，或不仅仅是组织学慢性化病变的结果，而可能是造成损伤进展的原因。然而，鉴于近期有研究发现p16表达可能阻碍纤维化的进展，衰老机制在移植肾慢性组织学损伤的贡献尚需更多的工作阐明。

结论及展望

    除了正常的老化过程，多种病理情况影响并加速衰老的进程。目前大多数研究仅限于动物模型，相关理论是否适用于人类尚需进一步认识；尽管对于肾组织复制衰老的现象有了更深一步的了解，但具体诱发细胞衰老的原因、其效应机制及在肾组织功能和形态学上的后果都还不清楚。关于细胞衰老的研究，为预测肾移植预后、评估免疫抑制剂及其他治疗方案、进一步认识移植肾脏病变机制，提供一个新的视角、新的研究方法和认识途径，在肾移植领域将显示其重要价值。另外值得一提的是，细胞衰老的现象和机制在原发肾脏疾病的研究与认识也非常值得关注，在移植领域进行相关研究，参考原发肾脏疾病的研究方法和结果进行综合分析和思考，应当会带来更全面、更深入的认识。
参考文献 略