肾脏移植临床免疫耐受诱导的最佳方案研究进展

天明

【摘要】    补充短摘要内容
【关键词】  肾移植;   造血干细胞移植;  免疫耐受;   CD+＋细胞
新型免疫抑制剂的发展及临床应用，明显提高了临床肾移植的长期存活率。但是长期应用免疫抑制剂费用昂贵，还可能出现机会性感染、恶性肿瘤、代谢性疾病及药物不良反应等一系列并发症[1]。并且，相当一部分患者即使维持有效的免疫抑制剂剂量，仍不能完全抑制排斥反应。因此，临床希望寻求一种方法，能诱导免疫耐受（immunotolerance），即移植受体（recipient）在不使用或使用小剂量免疫抑制剂时，也能长期耐受移植物（graft）[1-2]。
通过动物实验研究和临床试验尝试，目前认为联合供体（donor）造血干细胞输注，或称造血干细胞移植，在受体体内建立异基因嵌合体（Allogenetic Chimerism），可以诱导免疫耐受[2]。现将主要在临床试验中取得的成效进行综述，并回顾造血干细胞移植在恶性血液病治疗中的发展，展望诱导免疫耐受的方案。
    一、肾移植联合造血干细胞移植的临床经验
1976年Monaco等学者[3]最早在抗淋巴细胞球蛋白诱导下，给尸体肾移植患者术后输注供体骨髓细胞后用常规剂量的泼尼松和硫唑嘌呤联合免疫抑制。随访8个月后发现患者没有发生肾脏排异，且血肌酐水平维持在正常水平（1.0 mg/dl,请按法定剂量改为g/L）。说明供体骨髓细胞可以被受体耐受，且可能诱导受体免疫耐受，为以后的临床试验开辟了先河。但患者最后因乙状结肠穿孔死亡，死亡时肾功能正常。








            
DOI：
作者单位：310003  浙江大学医学院附属第一医院肾脏病中心
近年来，国内、外学者经过不断探索，肾移植联合造血干细胞输注的临床研究取得了显著进展。其中文献报道的大多数案例采取的是供体骨髓细胞输注，少数用外周造血干细胞、或从骨髓、外周血分离的CD34＋细胞，分别都有免疫耐受成功的案例。
1.肾脏移植联合全骨髓细胞输注：1991年Barber等参照Monaco的模型，进行较大规模的尸体肾移植联合DMBC(请标注中文)输注的临床试验[4]。57例患者作为实验组，抗淋巴细胞球蛋白诱导下输注DMBC(请标注中文) (2～3)×108/kg，免疫抑制剂为常规剂量泼尼松+硫唑嘌呤+环孢素。与54例传统肾移植患者对照，平均随访16个月。结果显示治疗组只有3例患者发生移植肾排异（对照组有13例）；治疗组患者12个月和18个月移植肾存活率更高（90% vs 71%和85% vs 67%,请将这些%放入相应的月后,以示一目了然）。治疗组的17例患者进行了免疫抑制剂的减量，只有3例患者出现了轻度的迟发性排异。证实该方案可以增加肾移植的成功率，甚至诱导免疫耐受。
美国迈阿密大学医学院从1994开始进行肾移植联合供体骨髓细胞输注的非随机对照临床研究，文献报道时随访时间最长已有6年[5]。1994～1998年63例接受尸体肾移植患者联合供体骨髓细胞输注作为实验组，(7.01±1.9)×108/kg的细胞分次输注（或只单次输注一半）。术后使用与常规肾移植组（对照组）相同的免疫抑制剂方案：术后抗CD3单克隆抗体（OKT3）诱导，他克莫司＋骁悉＋甲泼尼龙维持治疗。平均随访3.7年，两组患者的急性排斥比较差异无统计学意义，但实验组患者的慢性排斥明显减少；实验组术后5.5年的移植肾存活率更高，发生肾功能持续上升（SCr(请标注中文) >=2 mg/dl,请按法定剂量改为g/L）也更少。1996～2000年活体肾移植患者术后输注供体骨髓细胞 [（1.8±1.9）×108/kg]与同期未输注供体骨髓细胞的活体肾移植患者对照，平均随访33.2个月后显示，急性排斥的发生率比较差异无统计学意义；实验组的免疫抑制剂使用量低于对照组，但差异无统计学意义；术后4年患者的生存率、移植肾的生存率比较差异均无统计学意义；虽然输注的供体骨髓细胞数量只有尸体供体时的1/4，骨髓中的嵌合体产生却更快。
1999～2004年本单位对83例肾功能衰竭患者进行了尸体肾移植联合供体骨髓细胞输注的临床试验[6]。输注供体骨髓细胞的量为（1.9±1.3）×108/kg，免疫抑制剂方案为常规剂量的泼尼松＋骁悉＋环孢素或Tac（FK-506,标注中文），与同期进行的常规尸体肾移植患者对照。平均随访43.2个月，结果表明两组患者的移植肾长期存活率、远期排斥发生率、肾功能比较差异均无统计学意义，但临床随访数据中，可以观察实验组仍有减少远期排斥发生率的趋势，术后第4年的移植肾存活率也明显优于对照组。
上述的临床研究证实肾移植联合骨髓移植是一项安全的操作，受体可以很好地耐受供体骨髓细胞，不增加感染等并发症的发生率，输注的骨髓细胞也没有引起供体抗宿主疾病。但是这些研究没有设计免疫耐受的诱导方案。
2．肾移植联合外周血干细胞输注：印度Gujarat器官移植科学研究所主要尝试大剂量外周造血干细胞输注诱导免疫耐受的方案。2000年该研究所报道了1项活体供肾联合大剂量外周造血干细胞输注与常规肾移植的对照研究[7]。治疗组100例患者分1次腔静脉和2次体静脉输注供体的外周造血干细胞，总细胞数为（3.9～35.4）×10E(E代表什么,请核对)8/kg，平均CD34＋的含量为1.1％。最后一次输注后1周进行肾移植手术，免疫抑制剂用泼尼松＋环孢素二联方案，泼尼松0.2 mg/kg连续用3个月后停用，环孢素常规剂量使用，维持其血药浓度在50～176 ng/ml(请按法定剂量改为g/L)。对照组100例患者则用环孢素＋泼尼松（0.6 mg/kg）＋硫唑嘌呤（2.5 mg/kg）治疗，3个月后泼尼松逐渐减量至10 mg/d。分别平均随访213 d和254 d后，治疗组移植肾的存活率为100％，只有1例患者死于败血症，均未发生供体抗宿主疾病。而对照组有2例因CMV(请标注中文)感染后发生移植肾失功；治疗组的肾功能水平和环孢素的用量均低于对照组。
2001年该单位更新了他们的研究数据[8]。173例治疗组与120例对照组比较，平均随访时间分别增至450 d和468 d。结果显示治疗组的患者生存率、移植肾存活率、肾功能水平、急性排斥和CMV(请标注中文)感染率均优于对照组；且发现输注的供体细胞越多，肾功能越好。另外治疗组的88例患者尝试停用环孢素，改用低剂量泼尼松（10 mg/d）和硫唑嘌呤（0.1 mg/kg）。结果21例出现肾功能水平上升，重新使用环孢素后好转，8例因肝功能损害而停用硫唑嘌呤，1例则完全停用免疫抑制剂；最终所有试停药患者都保证了完好的肾功能，平均SCr(请标注中文)为1.3 mg/dl(请按法定剂量改为g/L)。
这说明大剂量的外周造血干细胞输注有利于肾移植成功，可以使用更少剂量的免疫抑制剂，也不会发生急性供体抗宿主疾病。但是由于随访时间较短，不能说明不会发生慢性供体抗宿主疾病或其他慢性并发症。
3．肾移植联合非清髓性骨髓移植：非清髓性骨髓移植又称减低预处理剂量的骨髓移植或小移植，其主要特点为化疗放疗预处理的剂量见效，不良反应减低，在治疗血液病时，主要适用于脏器功能不佳、年龄较大的患者进行骨髓移植[9]。
1998～2003年间美国哈佛医学院对6例多发性骨髓瘤、肾功能衰竭患者进行肾移植联合骨髓移植治疗[10]。供体为HLA(请标注中文)相合的同胞，先用非清髓性方案预处理，然后进行肾移植和骨髓移植，术后持续用环孢素2个月，并输注供体白细胞预防供体抗宿主疾病。结果有3例患者停用免疫抑制剂后，移植肾存活且肾功能完好，骨髓瘤的疗效也很好。该预处理方案主要是针对治疗多发性骨髓瘤而设计的，结果却实现了肾移植免疫耐受。因此他们认为在非清髓性的预处理下，肾移植联合骨髓移植可以诱导免疫耐受。2008年该机构又报道了5例终末期肾脏病患者的治疗方法[11]。患者经非清髓性预处理后，接受HLA(请标注中文)错配供体的肾移植和骨髓移植，术后免疫抑制剂用环孢素＋Tac（FK-506,请标注中文）＋骁悉。随访2.5～5.3年后，1例患者发生急性排斥而出现失功，另外4例患者的免疫抑制剂均逐渐减量直至完全停用，停药后肾功能保持稳定（Scr(请标注中文)<2.0 mg/dl(请按法定剂量改为g/L）。
这2项研究结果表明在非清髓预处理下，供体骨髓细胞输注可以诱导肾移植免疫耐受，但未描述输注的细胞量及时间。在血液病治疗时，非清髓性预处理方案主要用于HLA请标注中文)配型相合的供受体之间[12]。或许肾移植时，轻度减弱受体免疫力，供体骨髓细胞输注就可以诱导免疫耐受。
4．骨髓CD34＋细胞输注联合肾脏移植的临床研究：造血干细胞的来源包括骨髓（bone marrow）、G-CSF刺激后的外周血（peripheral blood）及脐血（uord blood），而“造血功能”由其中的全能干细胞（totipotent stem cell）及多功能干细胞（pluripotent stem cell）及多能干细胞（multipotent stem cell）等原始细胞完成[13]。这些原始造血干细胞具有相同的细胞表面抗原CD34[12]，通过分选CD34+细胞，造血干细胞移植能更好的重建受体的造血系统[12-13]。动物研究结果也发现，诱导免疫耐受过程中，CD34+细胞发挥着主要作用[14]。因此，有临床医生开始尝试用骨髓或外周血中纯化的CD34+细胞进行免疫诱导的试验。
2003年比利时的Lue De Pauw等学者首先报道了他们的研究成果[15]。他们抽取尸体供肾者的椎体骨髓，分离纯化其中CD34+细胞，肾移植术后在OKT3诱导下输入受体，细胞量为（0.6～3.7）×106/kg，OKT3输注前2 h静脉给予500 mgMP(请标注中文)。术后使用低剂量泼尼松＋硫唑嘌呤＋环孢素，并尝试将环孢素逐渐减量。随访5年，10例患者中有1例患者（完全配型）在移植后18个月成功停用激素，未发生供体抗宿主疾病。说明CD34+细胞的输注对肾移植患者无明显不良反应，且可能可以诱导免疫耐受。
但是，相似的临床研究并没有大量报道，可能是因为CD34+细胞分离过程复杂、耗费较大；骨髓中CD34+细胞含量较少，分选过程更加减少了其数量，不利于免疫耐受的形成；纯化的CD34+细胞输注诱导免疫耐受的效果不一定比全骨髓输注更好。
5．外周血CD34+细胞输注联合肾脏移植：美国Stanford大学的Samuel Strober等学者主要尝试用外周血分离的CD34+细胞诱导免疫耐受。2002年他们首先报道了对4例患者HLA(请标注中文)错配的活体肾移植联合PBSCT(请标注中文)的研究成果[16]。用G-CSF(请标注中文)刺激后收集外周血的单个核细胞，再将CD34+细胞分离纯化（含量>75%）并冷冻保存。在全淋巴照射＋ATG(请标注中文)诱导下，肾移植后输注CD34+细胞[(3～5)×10 E(E代表什么,请核对)6/kg]。用泼尼松＋环孢素联合进行免疫抑制，结果有1例患者在术后12个月完全撤除免疫抑制剂，1例患者在术后9个月撤除激素，环孢素A用量也逐渐减少。另1例患者术后发生了较轻的排斥反应，经过激素冲击治疗后好转。所有患者肾功能维持在1.0～1.7 mg/dl(请按法定剂量改为g/L)），且均未出现供体抗宿主疾病和全身性感染。
2008年该单位又报道了6例HLA(请标注中文)相合供受体间移植的新案例[17]。预处理方案与上述相同，输注CD34+的量为8×10 E(E代表什么,请核对)6/kg，免疫抑制剂加用骁悉。到该文章发表为止，有3例患者随访时间达1年以上，其中1例停用所有的免疫抑制剂，术后28个月肾功能仍正常（Scr(请标注中文)<2.0 mg/dl(请按法定剂量改为g/L)））；1例用环孢素＋骁悉维持，术后26个月Scr(请标注中文)为1.2 mg/dl(请按法定剂量改为g/L)）；另1例则单用环孢素维持下术后20个月Scr(请标注中文)维持在1.1 mg/dl(请按法定剂量改为g/L)）。
可见，外周血分离的CD34+细胞同样可以诱导免疫耐受。但也可能失败，可能与供受体之间的HLA(请标注中文)相合程度、受体的预处理方案、输注造血干细胞的数量和时机等有关。
二、不同类型造血干细胞移植在血液病治疗中的差别
下面，笔者通过对造血干细胞移植治疗血液疾病的发展回顾，比较不同造血干细胞移植的特点差异，从中探索造血干细胞移植诱导肾移植免疫耐受的方案。
1．骨髓移植与外周血干细胞移植的比较：治疗血液病的造血干细胞移植主要包括骨髓移植和外周造血干细胞移植，少数也采用脐血干细胞移植。在异基因移植中，越来越多的案例选用外周造血干细胞移植）[18]，因为多项临床随机对照试验[12,19,-21]表明，外周造血干细胞移植比较骨髓移植有以下特点：（1）移植后血象恢复快；（2）不增加急性供体抗宿主疾病的发生率，但也有些临床研究结果提示，急性供体抗宿主疾病的Ⅱ～Ⅳ期发生率增加10%～15％；（3）增加慢性供体抗宿主疾病的发生率；（4）术后短期（<100d）的感染率低，但长期（100d～365d）感染率更高，这可能与供体抗宿主疾病的发生有关；（5）移植失败的发生率及移植相关的病死率低，总的存活率高；（6）首次住院的总花费低，但再次住院的机会多。日本的循证研究也得出类似的结果，且无论是骨髓移植还是外周造血干细胞移植，供体抗宿主疾病的发生率均低于西方国家，可能与日本供受体之间的同源性有关[22]。
研究结果发现骨髓移植和外周造血干细胞移植之所以存在上述的差异，主要是因为移植物中细胞成分的差异，其中主要是CD34+细胞和CD3+细胞的含量差别，外周造血干细胞移植的移植物中CD34+细胞和CD3+细胞数量均高于骨髓移植[18]。前者作为原始干细胞，起重建造血系统的作用，后者则主要与免疫功能有关[12-13，20]。有作者提出[28]CD3+的量>0.83×10E(E代表什么,请核对)5/kg时，可能预示慢性供体抗宿主疾病的发生；而CD34+的量<4.6×10E(E代表什么,请核对)6/kg及CD3+的量<0.83×10E(E代表什么,请核对)5/kg，则会影响移植物的生存率。
另外对于供体而言[12-13，20，23]，骨髓移植的细胞收集需要住院麻醉诱导下进行，有严重的低血压、心跳骤停、败血症、骨髓炎，甚至死亡等不良反应，需要更久的恢复时间。而外周造血干细胞移植的供体需要注射G-CSF(请标注中文)，会有焦虑及G-CSF(请标注中文)的不良反应，总体承受的痛苦少，风险低，恢复快，花费少。
2.全骨髓移植和T淋巴细胞清除后骨髓移植的差异：由于供体抗宿主疾病与CD3+细胞的数量过多有关，研究者尝试将移植物适当去除CD3+细胞[31]，提高CD34+的百分含量。T淋巴细胞清除可以分为物理法、免疫法、物理-免疫联合法等[24]。研究结果表明免疫磁柱分选法可以有效清除4 logs的T淋巴细胞（主要为CD3+细胞），收集更高纯度的CD34+细胞[20]。那么，T淋巴细胞清除后的造血干细胞移植是否能发挥其预想的优势呢？
1991年美国血液病学会总结了过去5年中731例白血病患者的T淋巴细胞清除骨髓移植及2480例非T淋巴细胞清除骨髓移植病例 [25]。结果表明T淋巴细胞清除组急性供体抗宿主疾病和慢性供体抗宿主疾病的发生率均较非T淋巴细胞清除组低，但增加了移植失败率及白血病复发率。多因素分析结果表明白血病早期、大剂量的术前放疗、术后增强化疗等因素有利于T淋巴细胞清除骨髓移植患者的生存率；用免疫磁柱法去除T淋巴细胞的方法，比物理法和分次放疗法的治疗效果更差，无瘤生存率更低。相似的John E Wagner（请核对）等从1995～2000进行的多中心随机对照的前瞻性研究[26]也发现T淋巴细胞清除后白细胞恢复速度更快，急性供体抗宿主疾病的发生率更低，发生时间也较晚；慢性供体抗宿主疾病的发生率和发生时间无明显差异；T淋巴细胞清除组的CML(请标注中文)患者的复发率更高，术后1年内发生致死性感染更多；但两组的无瘤生存率比较差异无统计学意义。
说明骨髓中的T 淋巴细胞是移植物发挥免疫作用的来源，清除过多的T 淋巴细胞，相当于降低移植物的免疫力。对于恶性血液疾病的治疗，T淋巴细胞清除虽能减少移植物中CD3+细胞的含量，降低供体抗宿主疾病的发生率，但同时也降低了移植物抗肿瘤细胞的能力，使疾病复发率更高，移植效果更差[31]。研究者也尝试T淋巴细胞清除骨髓移植后进行T淋巴细胞的反输，证明适量的T淋巴细胞反输不会增加急性供体抗宿主疾病的发生率，同时也能保证移植物抗肿瘤细胞的作用[20,30]。
3．T淋巴细胞清除的骨髓移植与T淋巴细胞清除外周血干细胞移植的差别：T淋巴细胞清除是复杂、耗时、易错的实验室分离过程，该过程在清除T淋巴细胞的同时，也损害了很多CD34+细胞。因此Aversa等认为有了PBSC(请标注中文)的分离，BM(请标注中文)的分离就没有必要了[20]。
Jan J. Cornelissen（请核对）等学者研究分析了骨髓CD34+细胞移植与外周血CD34+细胞移植的差异[27]。结果外周血CD34+细胞移植的血象恢复更快，而急性供体抗宿主疾病发生率高于骨髓CD34+细胞移植。随访4年，骨髓CD34+细胞移植的总生存率为60％，高于外周血CD34+细胞移植的34％。他们认为血液病中干细胞移植的结局主要决定于移植物中CD3+细胞及CD34+细胞的量，大剂量的CD3+细胞所带来的缺点，可能掩盖了大剂量CD34+细胞的优点，过少的CD3+细胞也会引起疾病复发等问题。
目前造血干细胞移植治疗恶性血液疾病患者时，骨髓移植和外周造血干细胞移植都是标准方案[12]。临床应用时，无论采取哪种方案，主要是保证输注的单核细胞或CD34+细胞的数量[18]。有研究结果显示，可以在HLA(请标注中文)错配的移植时进行T淋巴细胞清除 [29]，但必须保证CD34+细胞>5.0×106/kg，最低不＜2.0×106/kg [20]。
    造血干细胞移植诱导免疫耐受的观点提出后，动物实验和临床试验已经证实：全骨髓细胞、外周血细胞、CD34+细胞的输注均可以诱导免疫耐受[35]。其机制可能是输注的造血干细胞被受体接受并在其体内增殖，形成嵌合体[2]。虽然多数研究结果表明，稳定的嵌合体及高含量的供体细胞有利于诱导免疫耐受[2,15,29]，但也有研究结果说明，暂时的嵌合体或微嵌合体（Microchemerism）也可以达到免疫耐受状态[2]。
回顾造血干细胞移植治疗恶性血液病的历史，造血干细胞移植方案的发展过程其实是探索供受体免疫力平衡的过程。移植成功的目标是：既不因受体免疫过强而排斥，也不因供体免疫过强而出现供体抗宿主疾病。造血干细胞移植治疗恶性血液病时，需要高强度的预处理方案，以尽可能清除肿瘤细胞，同时也严重损害了受体的免疫力，因此常常出现供体抗宿主疾病，尤其是在含较多T淋巴细胞的外周造血干细胞移植时；而T淋巴细胞清除后移植的方案，则由于损伤了移植物（供体）的免疫力，而容易出现移植失败、肿瘤复发等问题。
造血干细胞移植诱导免疫耐受方案的制定，也是为了寻求供受体免疫力的平衡状态。输注的造血干细胞细胞被受体接受，在受体体内形成供体的免疫力，使别的移植物可以免遭排斥。输注大剂量的供体细胞增强供体免疫力或非清髓性预处理减弱受体免疫力，平衡供受体之间的免疫力，均有利于免疫耐受的形成。肾移植患者本身免疫功能较完善，因此不易出现供体抗宿主疾病，也不必担心肿瘤复发问题。
除了常规造血干细胞移植外，印度Gujarat器官移植科学研究所还尝试将供体的骨髓细胞注入受体的胸腺、骨髓、肝脏和外周血中来诱导免疫耐受，取得了较好的临床疗效[36]，还制定了自己的操作规范——Ahmedabad tolerance induction protocol, ATIP(请标注中文)。这种方法成功的原因，可能是胸腺、骨髓、肝脏为免疫器官，直接将供体的造血干细胞引入这些器官发育成T淋巴细胞，当这些细胞成熟后，在受体的血液系统中循环，可以对供体的抗原有耐受性，从而不容易对移植物产生排斥。
无论机制如何，临床试验已经证明造血干细胞移植诱导免疫耐受的可行性，但需解决输注的细胞种类、细胞数量、输注时机以及预处理方案等问题。这些条件的选择，多数还处在动物实验阶段[37-41]，仍需要很长时间的临床实践探索。此外，临床还需要更长的随访观察，来确定是否会出现慢性排斥或慢性供体抗宿主疾病，免疫耐受持续时间；同时还需要考虑术后免疫抑制剂的调整、术后感染、手术花费、手术安全性等临床实际问题。