雷帕霉素及环孢素对人类调节性T细胞增殖影响的实验研究

大光

雷帕霉素及环孢素对人类调节性T细胞增殖影响的实验研究
【作者】 赵冰清；
【导师】 朱志军；
【作者基本信息】 天津医科大学， 外科学， 2013， 硕士

【摘要】

[目的]
体外提取培养人类外周血CD4+CD25+调节性T细胞(regulatory T cell， Treg)，并验证其免疫抑制功能；分别观察雷帕霉素及环孢素对CD4+CD25+Treg细胞体外增殖的影响，初步探讨其可能机制。

[方法]
本实验分为两部分：第一部分，人类外周血CD4+CD25+Treg细胞的体外提取培养及功能验证：取新鲜健康成人外周血50-100mL，利用密度梯度离心法得到外周血单核细胞，然后使用人类CD4+CD25+CD127dim/-T细胞分离试剂盒Ⅱ，通过免疫磁珠法进一步提取得到CD4+CD25+Treg细胞，利用流式细胞仪检测CD4、CD25双阳性细胞纯度，然后取一部分细胞进行羧基荧光素乙酰乙酸染色，连同未经染色细胞分别转移至96孔板内进行培养，添加含CD3/CD28单克隆抗体所包被的磁珠及高浓度重组人IL-2等的RPMI-1640完全培养基，于37.5℃、饱和湿度、5%C02浓度条件下进行培养，7天后将染色细胞进行流式细胞仪检测明确其增殖情况，其余未染色CD4+CD25+Treg细胞继续培养7天，定期更换培养基，进行细胞计数及细胞传代；将免疫磁珠法阳性选择中所保留的CD4+CD25-T细胞(效应性T细胞)用羧基荧光素乙酰乙酸标记后与同种同体CD4+CD25+Treg细胞1：1混合培养7天，然后经流式细胞仪检测观察分析CD4+CD25-T细胞的受抑制情况；第二部分，雷帕霉素及环孢素对人体外周血CD4+CD25+Treg细胞体外增殖的影响：将提取所得CD4+CD25+Treg细胞全部进行羧基荧光素乙酰乙酸标记，然后将细胞分成三组，每组至少设置3个复孔进行培养，在加入上述培养基的基础上，第一组添加浓度为100nmol/L的雷帕霉素试剂，第二组添加浓度为410nmol/L的环孢素试剂，第三组为空白对照组，不添加任何其他试剂。三组细胞于相同环境下培养，定期更换培养基并添加相应试剂，7天后进行流式细胞仪检测，分析两种药物对CD4+CD25+Treg细胞体外增殖的影响。数据运用SPSS13.0软件进行统计学处理，结果以均数±标准差表示，采用配对样本t检验，检验水准α=0.05。

[结果]
第一部分：通过密度梯度离心法结合免疫磁珠法共提取CD4+CD25+Treg细胞15例，其中1例出现细胞污染，6例双阳性率低于80%，予以丢弃，其余8例CD4+CD25+Treg细胞纯度达到(97±0.8)%，且细胞内Foxp3表达率达(99±0.5)%。CD4+CD25+Treg细胞体外正常分化增殖，适宜条件下培养7天后流式细胞仪检测原代细胞比例占(37.0±3.5)%，14天后光学显微镜下计数细胞数量可扩增至150倍左右；体外CD4+CD25+Treg细胞与CD4+CD25-T淋巴细胞1：1混合培养7天后，流式细胞仪检测CD4+CD25-T淋巴细胞原代细胞比例占(79.4±6.9)%，经统计学分析CD4+CD25+Treg细胞可明显抑制CD4+CD25T淋巴细胞的增殖(P<0.05)。第二部分：雷帕霉素组中CD4+CD25+Treg细胞培养7天后经流式细胞仪检测原代细胞所占比例为(8.8±3.2)%，空白对照组中原代细胞所占比例为(33.2±4.3)%，通过统计学分析可知雷帕霉素明显促进了CD4+CD25+Treg细胞的体外增殖(P<0.05)；相反的，经检测环孢素组中，CD4+CD25+Treg细胞培养7天后原代细胞所占比例为(48.9±7.0)%，与空白对照组相比，环孢素明显抑制CD4+CD25+Treg细胞的体外增殖(P<0.05)。

[结论]
①免疫磁珠法提取得到的CD4+CD25+Treg细胞纯度可达到95%以上，Foxp3表达率达99%以上，且具有省时高效、便于操作等众多优点，是进行CD4+CD25+Treg细胞相关研究的理想提取方式；
②雷帕霉素对CD4+CD25+Treg细胞的体外增殖起着明显促进作用，而环孢素则抑制CD4+CD25+Treg细胞的增殖分化，可见从CD4+CD25+Treg细胞的角度分析，雷帕霉素一定程度上有利于移植后患者免疫耐受的形成，而环孢素则不利于其形成。

平安树

意思是  还是吃雷帕好啊？

笑乐汉

雷帕好{:soso_e179:}

多来米

我特别想知道结论是什么，大光用老百姓的话说来听听

大光

多来米 发表于 2014-8-12 15:21
我特别想知道结论是什么，大光用老百姓的话说来听听

这是个体外的实验研究，研究的是它抗排斥治疗效应的一个点。从这个帖子看不出谁好谁孬。其他的评论不了啦。

多来米

用雷帕鸣后，我是口腔溃疡时不时出来，烦死了，这段时间一直有换回FK的念想，可又没有这胆量。