多能干细胞与肾脏再生的研究进展

大光

多能干细胞与肾脏再生的研究进展
作者： 黄佳卉1， 汪泱1'2， 王共先1
作者单位：1 南昌大学第一附属医院泌尿外科研究所； 2 上海交通大学创伤骨科研究所；
来源：《上海交通大学学报（医学版）》 2013年1月 第33卷第1期


    近年来，肾功能不全晚期患者数量呈现快速增长趋势，成为世界性医治难题之一。肾脏移植技术因可改善患者的生活质量并延长生命而成为临床上比较有效的治疗手段，然而肾脏移植术也存在缺陷。首先，全球每年新增的肾功能不全晚期患者人数不断增长，而供体肾脏却非常有限；其二，移植成功后的免疫排斥反应以及终身服用免疫抑制剂给患者及其家庭带来严重的经济负担。解决这些问题最直接的手段就是利用多能干细胞促使肾脏再生，而近几年研究较多的胚胎干细胞(embryonic stem cells)和诱导性多能干细胞(induced pluripolent stem cells,iPS cells)在组织、器官再生方面显示出良好的应用前景。多能干细胞具有无限的自我增殖能力及在体内可分化成为多种类型细胞的特点。有研究表明，多能干细胞可为细胞替代治疗及组织器官再生、疾病模型、药物研发和毒理学提供丰富的资源。从胚胎干细胞中再生出有特殊功能的细胞类型已有相关报道，包括神经、血管内皮组织、心肌细胞、造血细胞、分泌胰岛素样细胞及肝细胞样细胞，而多能干细胞向肾系细胞分化的报道相对较少。本文就近年来胚胎于细胞和iPS细胞向肾系细胞分化及iPS细胞在肾脏疾病治疗等方面的研究进展进行综述。

1 胚胎干细胞向肾系细胞分化

    目前，关于胚胎干细胞向肾系细胞分化的研究主要集中在利用特定诱导因子定向诱导分化、模拟体内特殊微环境和通过拟胚体(embrvoid bodies)自然分化等三种策略。

1.1 特定因子诱导胚胎干细胞向肾系细胞分化

    2000年，Schuldiner等英国学者向胚胎干细胞发育成拟胚体后的培养液中添加了8种生长因子，并通过观察分化过程中各个胚层相关标志物的变化水平来研究这8种生长因子在胚胎干细胞细胞分化过程中的作用。活化素A(activin-A)、转化生长因子β1(transforming gowth factor-βl,TGF-βl)主要诱导中胚层细胞分化；维甲酸(retinoic acid,RA)、表皮生长因子(epidermal gowth factor,EGF)、骨形态发生蛋白4(bone morphogenetic protein 4,BMP4)、碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)活化外胚层和中胚层标志物；神经生长因子(nerve growth fact,NGF)和肝细胞生长因子(hepatocyte gowth factor,HGF)均可诱导向3个胚层分化，没有任何一个因子可以直接诱导向一个胚层细胞类型分化。无生长因子时，胚胎干细胞可自发地分化成许多不同的克隆类型；而添加生长因子后，胚胎干细胞便可诱导生成更多形态更成熟的细胞，如肌细胞和神经细胞等。

    从肾脏发育学来看，后肾最初是源于间介中胚层；后肾的发生和发展是输尿管牙基与间充质牙基在一系列诱导信号分子作用下发生复杂的间充质细胞向上皮组织转化而形成的。采用RT-PCR技术，Schuldiner等发现了4个肾脏相关基因：威尔氏瘤抑制基因(Wilms'tumor suppressor gene,WT-1)、Adrenal maker、Rennin和Kallikrein。WT-1是Wilms肿瘤的抑制基因，在早期肾脏生成中扮演核心角色，它在间充质细胞向上皮组织转化中介导诱导信号，且只有添加NGF或HGF后方可检测到WT-1；Adrenal marker、Rennin和Ka11ikrein则均为肾小球球旁器分泌的因子，参与心血管系统调节。

    2005年，Kobayashi等日本学者采用电转方法将Wnt4 cDNA转染到鼠胚胎干细胞中使之成为Wnt4-胚胎干细胞，经体外实验发现，Wnt4-胚胎干细胞发育成的拟胚体在悬浮培养15～20d时可检测到水通道蛋白2(aquaporins 2,AQP2)mRNA和蛋白的表达，HGF和activin-A存在时AQP2的表达有所增强。经体内实验发现，在Wnt4-胚胎干细胞注射至鼠肾皮质4周后可有类似肾小管样结构形成。Kim等美国学者联合使用RA、activin-A和BMP7等生肾因子复合体培养鼠胚胎干细胞，经过拟胚体途径悬浮培养5d后发现有中胚层的特殊标志物配对盒基因(paired-box genes 2,PAX2)、WT-1、Wnt4等表达，将暴露过生肾因子的胚胎干细胞注入肾脏发育缺陷的个体肾中可形成肾小管上皮样结构，效率接近100%；RA和activin-A能够有效地刺激PAX2、WT-1表达提高20～30倍；此外，研究还发现中胚层本身不会形成肾小管，只有在输尿管牙基或异源性诱导物如脊髓或外源性Wnt4的诱导后才能形成肾小管。2007年Vigneau等发现，在无白血病抑制因子(1eukemia inhibitory ,LIF)的情况下，鼠胚胎干细胞生成拟胚体，该拟胚体会向中胚层分化；用10ng/mL的activin-A培养拟胚体，4d后检测到钙粘连蛋白11、WT-1、PAX-2和Wnt4等肾脏标志物的表达，利用荧光激活细胞分类器选择富集LacZ/T/绿色荧光蛋白(green fluorent protein,GFP)阳性细胞(GFP+)(将GFP、LacZ分别敲入鼠胚胎干细胞系功能区T座位和RosA 26座位)，在将该LacZ/T/GFP+细胞注入处于器官培养环境中的胚肾5d后，β-半乳糖苷酶免疫组织化学检测发现LacZ/T/GFP+细胞插入并整合到生肾区的牙基细胞中；共区域化研究发现，单独注射至发育中的新生鼠肾脏后的LacZ/T/GFP+细胞稳定地聚合成近端小管并具有正常的形态、碱性磷酸酶(a1kaline phosphatase,AP)染色阳性、表达AQP1、无肿瘤形成。但以上研究仅局限于鼠类，是否可被用于人类胚胎干细胞的定向分化尚未见报道。

    2009年，Batche1der等采用免疫组织化学方法和PCR技术对猕猴胚胎发育不同时期的肾脏发育相关标志物进行检测，结果显示PAX2表达于肾输尿管牙基和肾小囊泡中；波形蛋白(间充质与肾脏标志物)高表达于肾牙基，但仅存在于肾髓质、肾皮质的肾小球与间充质细胞中；人类胚胎干细胞自发性分化时，后肾间充质标志物的表达随培养时间的延长逐渐增强，如OSR1(odd-skipped re1ated 1)、PAX2、SIX2和WT-1,随后肾脏发育相关基因(EYA1、LIM1、CD24)表达上调；加入RA、activin-A、BMP4或BMP7进行定向诱导分化，PAX2和波形蛋白的免疫反应性与猕猴的肾前体发生相似。2010年，Mac等利用一些小分子组合物直接诱导鼠胚胎干细胞单层细胞向中胚层分化，首先将酪氨酸激酶抑制剂(JAK-inh)、磷脂酰肌醇激酶信号通路抑制剂(LY294002)、RhoA转录子信号抑制剂(CCG1423)和RA这4个小分子化合物组合后加入胚胎干细胞培养液中，8d后分别提取总RNA用于RT-PCR、定量PCR和免疫荧光检测。检测结果表明：经4个小分子化合物处理过的胚胎干细胞中大于1/2数量的细胞ORS1呈阳性(ORS1是中胚层分化所必需的)，另外还检测到中胚层标志物PAX2,而外胚层和内胚层的标志物未被检测到；RT-PCR检测发现了在肾发育过程中不可或缺的基因Lim1和WT-1的表达。由此可见，以上4个小分子化合物的组合实现了对中胚层的定向诱导分化。

1.2 共培养诱导胚胎干细胞向肾系细胞分化

    与利用特殊诱导因子诱导胚胎干细胞向肾系细胞分化不同，胚胎干细胞在特殊培养环境中也可以向肾系细胞分化。1998年，Thomson等发现人类胚胎干细胞在注入免疫缺陷鼠体内后形成的畸胎瘤中存在肾小管结构。2005年，Steenhard等将广泛表达β-半乳糖苷酶的鼠ROSA26胚胎干细胞显微注射至孕12d(E12)和孕13d(E13)的小鼠后肾中进行器官培养，5d后发现这些胚胎干细胞在胚肾内逐渐发育成肾小管样结构，且有少数胚胎干细胞发育成类似血管小球簇样结构；电子显微镜观察发现胚胎干细胞衍生的肾小管样结构被基膜包围，并且还有向顶生长的复纤毛；标志物分析发现这些小管样上皮细胞亚型与Lotus tetragonolobus连接在一起并表达WT-1和α1 Na/K ATP酶。2011年，国内学者汪泱等的研究发现，在与胚肾微环境共培养3d后，小鼠胚胎干细胞有不同时期肾脏发育相关基因的表达，如Pax2、WT-1、Emx2、胶质细胞源性神经营养因子(glial ce11 line-derived neurotrophic factor，GDNF)、Nephl、Nephrin、肾小管特殊标志物KSP和CD24。以上研究结果表明，胚肾微环境可促进胚胎干细胞向肾系细胞分化，胚胎期细胞微环境在胚胎干细胞转分化过程中发挥重要作用。

1.3 经拟胚体途径自发性向肾系细胞分化

    胚胎干细胞具有自我增殖并向三胚层所有细胞类型分化的潜能，包括由中胚层而来的肾系细胞。2006年，Kramer等在对鼠胚胎干细胞衍生的拟胚体体外自发性分化过程的研究中发现了肾脏标志物(Podocin、Nephrin、WT-1、T-H蛋白、肾特异性氧化还原酶、肾雄激素相关蛋白、25-羟基维生素D3羟化酶等)的表达，但是这种自发性的分化效率很低且分化不定向，且以成纤维细胞生长因子2(fibrob1ast gowth factor 2,FGF-2)和LIF进行诱导并未提高分化效率。

2 iPs细胞向肾系细胞分化

    iPS细胞与胚胎干细胞同样具有无限的自我增殖能力和广泛的分化潜质，为肾脏再生提供了前所未有的机遇，但诱导iPS细胞向肾系细胞定向分化的研究仍鲜有提及。分析原因主要有以下几点：第一，与胚胎干细胞相比，iPS细胞属于一个新兴的研究领域，而对iPS细胞的肾脏再生研究更为少见；第二，肾脏是一个解剖学结构比较复杂的器官，共有26种不同类型的细胞，其形态发生要比肝脏、神经、血液复杂；第三，尽管有许多研究者致力于多能干细胞向肾脏分化的研究，但因肾脏结构复杂，目前仍未能形成一套比较高效、系统且完善的诱导方案。

    2009年，日本学者Kramer等利用反转录病毒将Sox2、Klf4、Oct4、C-myc转染鼠成纤维细胞使之重编程为iPS细胞，之后将500个胚胎干细胞或700个iPS细胞用悬滴法养成拟胚体，利用含有activin-A、GDNF、BMP7、Gremlin、生长分化因子11(gowth differentiation factor 11,GDF11)、Wnt4的培养液诱导拟胚体分化，3d后转人明胶包被的培养板中诱导培养至18d，定量PCR检测发现胚胎干细胞和iPS细胞均表达肾脏相关标志物，如中胚层和后肾间充质标志物Six2、WT-1、PAX2的表达明显增强，足细胞标志物WT-1和Nephrin均有表达，KSP表达逐渐增加。在胚胎干细胞中，GDF11和BMP7对胚胎干细胞向后肾问充质分化有诱导增强作用，activin-A则促进胚胎干细胞向肾小管细胞分化；在iPS细胞中，Activin-A对其向肾小管细胞分化有诱导增强作用，但是这种增强作用较诱导胚胎干细胞弱。

    iPS细胞具有先天的记忆功能，可分化为其最初来源的细胞。2012年，Song等首次报道：人类肾小球系膜细胞重新编程而来的iPS细胞经生肾因子RA、activin-A和BMP7诱导10d后便具有了肾小球足细胞的特征，如WT-1、Nephrin、突触蛋白(synaptopodin)的表达上调；去除生肾因子后，该iPS细胞来源的足细胞仍然具有增殖活性，并且证实这些足细胞具有摄取蛋白的功能及对血管紧张素Ⅱ的反应性。该项研究在一定程度上解决了之前关于肾小球诱导分化困难的问题，为后继研究开拓了思路。

3 iPS细胞的治疗应用研究

    iPS细胞的治疗主要应用在再生医学方面，如细胞治疗、器官再造及移植等。iPS细胞在体外可成功分化为神经元、神经胶质细胞、心血管细胞和原始生殖细胞等；利用特异性的iPS细胞成功治愈或有望治愈的疾病也已有相应的报道，如镰状红细胞贫血症、家族型肌萎缩性脊髓侧索硬化症(amyotrophic latera1 sclerosis,ALS)、血友病A、Fanconi贫血症等，提示iPS细胞在临床治疗方面具有巨大的潜力。

    从肾脏的胚胎起源来看，人类肾脏起源于中胚层节外侧的生肾索，生肾索尾端发育成后肾，即人类肾脏。人类妊娠32d,中肾管的后肾间充质分泌GDNF,诱导中肾管尾端向背侧长出输尿管芽，输尿管芽与后肾间充质相互诱导，促进肾脏发育成熟。后肾发育异常可引起多种先天性肾脏疾病，而胚胎干细胞和iPS细胞具有多能性，在体内、体外均可形成与子宫内发育的胚胎近似的拟胚体，该拟胚体可以生成3个胚层来源的任何一种细胞，包括肾脏中的26种细胞，从而使多能干细胞用于肾脏再造与移植具有一定的可行性。

    iPS细胞在肾脏疾病治疗方面的研究才刚刚起步。2012年，台湾学者Lee等将无c-myc的iPS细胞通过肾内动脉显微注射到由缺血再灌注引起的急性肾损伤的远交群(Sprague Daw1ey,SD)大鼠体内，该实验得出了以下3个重要结论：①iPS细胞的肾内动脉注射减轻了缺血再灌注导致的急性肾损伤的病理损伤程度；②iPS细胞移植改善了急性肾损伤大鼠的肾功能，显著降低了急性肾损伤相关的病死率；③iPS细胞在肾损伤方面体现了抗氧化应激、抗炎症反应以及抗凋亡效应。但是iPS细胞治疗因某些外源性基因的插入可能引起基因紊乱，为克服这一缺憾，Cheng等通过iPS细胞自发性的有丝分裂重组将基因突变的杂合子PKD1+/-成功修复为PKD1+/R+,通过DNA印迹杂交和基因PCR分析显示突变修复的PS细胞的基因型与野生型细胞的基因型无明显差异；更为重要的是，在携带有PKD1+/R+ iPS细胞的成年嵌合体小鼠中囊肿形成的概率明显低于携带有近亲PKD1+/- iPS细胞的成年嵌合体小鼠，且与野生型鼠比较无统计学差异。由此可见，利用iPS细胞有丝分裂重组介导的基因修复手段在医学上是可行的，虽然同源染色体兼得重组发生概率只有1～2次/10^4个iPS细胞。

4 展望

    虽然多能干细胞在肾脏再生的研究中取得了一定进展，其中比较有意义的是利用特殊因子诱导胚胎干细胞和iPS细胞定向分化为肾小管样细胞和肾小球足细胞，但还是存在着一些问题，如胚胎干细胞和iPS细胞移植物的致瘤性、肾小囊样细胞定向分化很少见、iPS细胞诱导分化敏感性弱、缺乏规范统一的诱导分化体系以及科学研究成果与临床应用的转化还存在很长的距离，特别是iPs细胞技术兴起不久，对iPS细胞的研究更多地还只是停留在优化重编程体系方面，而诱导iPS细胞向肾系细胞分化的研究相对较少的主要原因是iPS细胞培养条件苛刻，肾脏的解剖结构及细胞组成较其他器官复杂。寻找更加有效的诱寻方案将成为未来肾脏再生的研究热点。

参考文献 略

禾心

虽然。。。。。但是。。。。。，唉！

般若

  从肾脏发育学来看，后肾最初是源于间介中胚层；后肾的发生和发展是输尿管牙基与间充质牙基在一系列诱导信号分子作用下发生复杂的间充质细胞向上皮组织转化而形成的。采用RT-PCR技术，Schuldiner等发现了4个肾脏相关基因：威尔氏瘤抑制基因(Wilms'tumor suppressor gene,WT-1)、Adrenal maker、Rennin和Kallikrein。WT-1是Wilms肿瘤的抑制基因，在早期肾脏生成中扮演核心角色，它在间充质细胞向上皮组织转化中介导诱导信号，且只有添加NGF或HGF后方可检测到WT-1；Adrenal marker、Rennin和Ka11ikrein则均为肾小球球旁器分泌的因子，参与心血管系统调节。