调节性T细胞体外诱导及其在器官移植中应用的研究进展

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调节性T细胞体外诱导及其在器官移植中应用的研究进展
作者：覃伟 综述；杨扬 审校
作者单位:中山大学附属第三医院肝移植中心 中山大学器官移植研究所 广东省器官移植中心
来源：《器官移植》 2014年9月 第5卷第5期


    器官移植是目前国内外公认的治疗终末期疾病、挽救生命和提高生存质量的有效措施。移植后免疫排斥反应仍是器官移植的主要术后并发症，影响受者长期存活。虽然免疫抑制剂在临床应用中显示了良好的效果，但这些药物长期应用会使受者处于免疫低下状态，进而发生感染、肿瘤及其他并发症。

    调节性T细胞(Treg)是一群具有免疫负调控功能的CD4+T淋巴细胞亚群，占外周CD4+T淋巴细胞的5%～10%。Treg通过抑制其他免疫效应细胞的激活和增殖，在诱导移植免疫耐受过程中发挥重要作用。现就Treg体外诱导及其在器官移植中应用的研究进展作一综述。

1  调节性T细胞的特征

    Treg是目前研究最多、临床应用效果最为明确的调节性免疫细胞，尤其是CD4+CD25+Foxp3+Treg。Treg除了特异性地表达 CD4+CD25+Foxp3+Treg［白细胞介素(IL)-2α受体链］以外，还表达Foxp3、细胞毒性T淋巴细胞抗原4(CTLA-4)、糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子(TNF) 受 体 (GITR)等。CTLA-4是T淋巴细胞活化的负调节因子，通过提供第二信号活化T淋巴细胞，可阻断协同刺激通路诱导免疫无能，从而抑制移植排斥反应。GITR是Treg早期激活的重要共刺激分子。尽管上述Treg的表面标志物在其发育和功能发挥中起着重要作用，但同样可在活化的CD4+T淋巴细胞上表达，并非Treg的特异性表面标志物。有上述两种分子阳性的Treg均表达特征性的转录因子Foxp3，且Foxp3 并非是细胞活化的表面标志物，因而，Foxp3被认为是Treg重要的表面标志物，在Treg的发育、诱导及功能发挥等方面起着重要作用。在小鼠及人类中，Foxp3基因缺失将使T淋巴细胞大量增殖，并导致多个器官发生自身免疫性损伤，Foxp3可以稳定抑制性分子CD39、CTLA4和IL-35的表达。越来越多的证据表明，小鼠的Treg易被确认，而人类的Treg具有更多的异质性，有关人类的Treg特有的表面标志物正在深入研究中。

2  调节性T细胞介导免疫耐受的机制

    目前认为Treg抑制效应性T细胞功能的机制包括以下几个方面1)细胞-细胞紧密接触抑制效应性T细胞中IL-2的产生;(2)阻止抗原提呈细胞( APC)共刺激分子(如CD80、CD86)的表达和树突状细胞(DC) 的成熟;(3)通过颗粒酶/穿孔素死亡通路溶解靶细胞;(4)消耗局部IL-2，从而使得效应性T细胞失去刺激信号;(5)抑制性细胞因子的产生，如转化生长因子(TGF)-β、IL-10和IL-35。因此，Treg的选择性抑制是各种抑制机制相互协调的结果。此外，体内成像研究表明，Treg特异性地与DC相互作用，干扰效应性T细胞与DC的结合，从而阻止效应性T细胞发挥作用。最近有研究发现，髓样抑制细胞(MDSC)可通过B7-H1通路扩增Treg， 进而保护移植的胰岛细胞。 另Chattopadhyay等研究发现，MARCH1是一种E3泛素连接酶，可降解DC表面的CD86和主要组织相容性复合体(MHC)Ⅱ，而CD83具有中和MARCH1效应的作用。经诱导性Treg(iTreg)处理后的DC，MARCH1表达升高而CD83表达降低，而这种作用均由Treg分泌的IL-10所介导。故研究者认为，Treg调节DC的功能是通过IL-10影响MARCH1和CD83的表达水平进而发挥作用的。

3  调节性T细胞体外诱导扩增的方法和策略

    Treg治疗方法具有作用时间持久、低毒和靶向特定抗原的特点，体外诱导产生大量表型稳定和功能强大的Treg具有重要临床意义。

3.1 非特异性诱导扩增

    在体外，TGF-β和IL-2是促进幼稚祖细胞来源Treg分化的强有力的诱导因子。T细胞受体(TCR) 受信号的强刺激，加上外源性高浓度的IL-2(10～2000U/ml)可以打破Treg的无能状态。常用的刺激方法包括抗CD3/CD28或者APC加抗原，已知方案可使人类Treg在体外扩增100～13000倍。Hoffmann等研究表明，在大剂量IL-2存在的条件下，体外利用偶联CD3和CD28单克隆抗体的人APC，可获得数倍的扩增。与新分离的Treg相比，扩增得到的Treg具有更强的免疫抑制功能。

    在炎症环境条件下，Treg可被“策反”转化成辅助性T(Th)17细胞，Th17细胞可加剧炎症反应并刺激排斥反应。有关研究表明，IL-6通过AKT 路径可阻断Foxp3表达; 而在炎症因子存在的情况下，西罗莫司(雷帕霉素)可封闭AKT信号路径的下游信号，抑制Th17细胞的扩增同时维持Foxp3稳定表达。维A酸也能够通过改变IL-6R的表达和它的下游信号维持Treg的稳定性。Zhang等研究表明，在成熟DC刺激或抗CD3/CD28抗体刺激体外培养体系中，,TGF-β1/Fc融合蛋白与西罗莫司均可单独诱导幼稚CD4+Foxp3-T细胞分化成Foxp3+Treg，联合应用TGF-β1/Fc融合蛋白和西罗莫司显著上调了Foxp3的表达。Hippen等研究表明，在西罗莫司、IL-2和APC［表达高亲和力抗体结合Fc受体(CD64)和共刺激分子CD86(CD28配体)并且负载有抗CD3抗体］存在的条件下，将免疫磁珠分选的Treg进行诱导细胞扩增，扩增得到的Treg稳定表达Foxp3，并且扩增将近3000倍。

    Lu等研究发现，在抗CD3/CD28抗体存在情况下，全反式维A酸(ATRA)能促进 ,TGF-β诱导的CD4+CD25-T淋巴细胞转化为Foxp3+Treg，并同时稳定表达Foxp3，这将有助于Treg增强免疫抑制功能，延长移植物抗宿主疾病(GVHD)小鼠生存期，从而为临床上器官免疫耐受的细胞治疗提供了可能。

3.2 抗原特异性诱导扩增

    Treg的抗原特异性可以促使其向靶器官迁移，局部发挥作用，避免系统性免疫抑制。在动物模型中，少量抗原特异性Treg即可以抑制自身免疫性疾病，阻断GVHD、骨髓移植和器官移植排斥反应。

    同种异体抗原提呈对诱导移植免疫耐受建立和供者特异性Treg的生成，具有十分重要的意义，将有助于采用混合嵌合体诱导免疫耐受的方式应用于实体器官移植。Feng等用同种异体APC(DC，用来活化TCR)和磷酸二酯酶3抑制剂(西洛酰胺)诱导产生小鼠Treg。DC既提供扩增所需要的CD28传导信号，又提呈特异性抗原，从而赋予Treg抗原特异性。Sagoo等报道用同种异体DC诱导供体Treg的方法，此法诱导产生的抗原特异性Treg能识别完整的人类白细胞抗原(HLA)-DR抗原，使CD3+Foxp3+细胞比例明显增加。

    将抗原特异性TCR Vα和Vβ链 ( 能识别特异性抗原肽)基因转染至多克隆性Foxp3+细胞后，这些抗原特异性Treg表达有组织特异性归巢受体，导致其在小鼠特定位置产生炎性关节炎，在器官移植术后进行排斥反应的免疫调节。Peters等采用抗原特异性扩增与广谱扩增法相结合的方式，解决了扩增倍数低和抗原特异性差的问题。

4  调节性T细胞在器官移植领域中的应用

    大量研究证实，将体外诱导扩增的Treg注入相应的动物模型中，Treg在诱导免疫耐受及减轻移植排斥反应方面发挥着重要的作用。与传统药物治疗相比，Treg细胞治疗有着自身的优势，如Treg可以调节抗原特异性免疫反应，避免传统免疫抑制药物的不良反应; 从患者外周血中获取的Treg不会被其自身的免疫系统排斥; 在小鼠体内进行Treg治疗的结果显示可以重建免疫耐受且作用时间持久。因此，如何将Treg向临床转化，诱导机体免疫耐受的建立是目前研究的热点。

    早在2000年初，数个研究小组的研究表明，Treg可用于治疗小鼠GVHD。从此，各项研究工作陆续展开，很多研究者对人类GVHD与CD4+CD25+Treg之间的关系进行了研究，但研究结果不一。直到2009年，临床上才首次选择了骨髓移植患者进行Treg治疗。Trzonkowski等将Treg应用于临床骨髓移植术后GVHD治疗，其中1例受者术后第137日发生GVHD，采用他克莫司 + 吗替麦考酚酯 + 泼尼松治疗，后因患者出现药物不良反应停用吗替麦考酚酯，输注体外扩增的同一供者的CD4+CD25+天然性Treg(nTreg)(10×10^5/kg)，并减少肾上腺皮质激素用量后无复发。Edinger等将供者的Treg(5×10^6/kg)，Foxp3+＞50%)输注到干细胞移植受者体内，受者同时停止服用预防GVHD的药物，9例受者均未发生GVHD、输注不良反应、严重感染及初始疾病复发等情况。

    尽管上述的小规模临床研究未能确切证实Treg的临床价值，但急性毒性反应小已使研究者对Treg在临床移植中的应用充满了信心。其他研究结果亦表明，在临床治疗上输注Treg是安全可行的。因此，临床上将Treg用于移植领域和Ⅰ型糖尿病治疗的各种临床试验已陆续开展。其中，欧盟赞 助了一项Ⅰ/Ⅱ期多中心的研究“One Study”，该研究用于评估体外扩增的Treg在肾移植受者体内的安全性。此研究(2010年至2015年)的目标是提高肾移植患者的长期生存时间、减少不良反应发生率和降低患者的医疗支出，但这些临床试验为建立安全有效的Treg输注标准，所采用的细胞剂量都具有较大的可变范围。
    Berglund等采用流式细胞术或磁性细胞术从尿毒症患者体内分离出CD4+CD25highCD127lowTreg。当成熟和耐受性异体DC分别作为饲养细胞进行Treg体外扩增时，Treg在功能特性及纯度上均存在明显差异，尤其是流式细胞术所分离的Treg与成熟DC进行体外扩增后，Treg能分泌出更多的IL-10和颗粒酶B。该研究采用不同的方法将尿毒症患者体内的Treg进行分离和扩增，并在功能特性等方面进行比较，这为Treg应用于肾移植奠定了基础。Sato等研究发现，行活体肝移植手术的患者，经门静脉注入供者特异性抗原后，能改变CD4+CD25+Foxp3+Treg的比例，从而发挥诱导免疫耐受的作用。另有学者研究发现，术前受者的Treg功能评估将有助于预测移植肾功能缓慢恢复和延迟恢复。这些研究对评估免疫耐受及指导临床治疗具有十分重要的意义。

5  调节性T细胞免疫治疗的局限性

    Treg在外周血中的免疫调节能力为实现免疫耐受提供了新的途径。目前关于Treg的数据大部分来源于啮齿类动物，与生长在无病原菌环境中的实验小鼠相比较，人类的免疫系统调控极为复杂，能与同种抗原交叉反应及应答，从而形成记忆性T细胞，可影响移植免疫抑制药物的治疗及免疫耐受诱导的成功。研究表明，记忆性T细胞对Treg的调节作用具有明显的抵制性。

    目前，普遍采用抗CD3/CD28抗体和外源性人IL-2在体外扩增Treg。由于采用免疫磁珠分选富集Treg不可能完全去除效应性T细胞，使得体外扩增后的Treg中混有大量的T淋巴细胞。同样，在供者血液中分离并纯化Treg也非常困难。一旦Treg分离出来，必须进行足量的Treg体外扩增。Treg具有高度异质性，其体外增殖可导致其特性转变和(或)转换为效应性T细胞(即Th1和Th17) ，这将导致Treg抑制能力的改变和前炎症环境的建立。Treg在扩增过程中产生抗原性，在炎症环境中Foxp3的表达具有不稳定性以及Treg治疗本身是否产生整体的免疫抑制等问题，都将制约Treg在移植免疫耐受方面向临床转化。此外，Treg在对于以血管增生硬化为主要病理表现的慢性排斥反应中能否发挥重要作用，改善移植物长期存活还需进一步评价。

6  展望

    目前，实验性小鼠模型已突显了Treg在介导同种移植免疫耐受中的重要性，使我们对Treg有了更为深刻的认识。由于人类Treg缺乏独特的细胞表面标志物及稳定性差等特性，现在还很难说Treg的临床应用前景一片光明。有研究表明，这些不稳定的Treg或污染的效应性T细胞虽不可能完全消除，但它们可被抗炎症的免疫抑制剂降低危害性，从而塑造一个有利于Treg增殖和抑制效应性T细胞功能的“炎症最小化”环境。随着在体外诱导扩增Treg技术的发展及对其发育、稳定性研究的不断深入，相信在不远的将来，我们借助扩增的Treg，采用Treg与多种免疫耐受方案、免疫抑制剂及间充质干细胞等联合应用的方法，将有利于器官排斥反应问题的解决，促使器官移植事业不断向前发展，造福广大移植患者。

参考文献:略