肾移植术后早期淋巴细胞及DSA监测在诊断移植排斥反应中的意义

大光

　　一、一般资料


　　选取2014年1月至2016年6月在西安交通大学第一附属医院肾病医院肾移植科接受肾脏移植术的患者454例，其中男341例，女113例，（41±11）岁。术后均采用环孢素/他克莫司＋霉酚酸酯＋激素免疫抑制方案。
　　入选标准：①首次接受肾脏移植受者；②术后均接受CNI（环孢素或他克莫司）为主的免疫抑制剂方案；③术后获定期门诊随访，且资料完整。


　　二、患者分组


　　所有患者根据术后肾功能情况分为肾功能稳定（SF）组和急性排斥反应（AR）组。
　　SF组：尿量及血清肌酐于肾脏移植术后3～7d恢复正常且保持稳定。免疫抑制剂浓度在本中心理想范围之内。肾脏移植术后6个月内未出现感染、AR以及药物性肾损害等表现。
　　AR组：①临床表现为发热、尿量减少、血压升高、移植肾区疼痛或肿胀感，移植肾肿大、质地变硬；②实验室检查，包括血清肌酐升高大于25μmol/L或较前1d升高10%～25%以上，尿常规示尿蛋白、红细胞重新出现，尿脱落细胞中检出淋巴细胞；③影像学检查，包括超声示移植肾肿大、血供减少、血管树显示不清、血管阻力指数＞0.8，移植肾ECT检查示核素排泄延迟、呈核素浓集表现；④病理检查符合Banff2013标准中AR的病理表现；⑤对抗排斥治疗有效。排除尿路梗阻、动脉狭窄、感染、免疫抑制剂中毒等原因所导致的血清肌酐升高。


　　三、检测方法


　　流式细胞术检测肾移植受者外周血淋巴细胞比例。肾移植受者术前、术后3、7、14、21、28、60、90d、发生AR当日及AR逆转后各留取样本1份。由于肾脏移植术后外周血淋巴细胞亚群可出现动态变化，我们按照术后时间一致的原则，从SF组中选择与排斥反应发生时间相同或接近（≤3d）的淋巴细胞亚群测定值作为对照。
　　采用特异性抗体检测法动态监测肾脏移植术后受者HLA抗体水平、供者特异性抗体（DSA）及非供者特异性抗体（NDSA）水平。DSA动态检测时间点为术后3、7、14、21、28、60、90d。中位荧光强度（MFI）≥500，结果判定为阳性。


　　四、肾脏移植受者抗排斥治疗方案及效果评价


　　移植肾活检病理证实AR后，静脉应用甲强龙（MP）500ｍg，连续3～5d；如MP总量大于3.0g后肾功能无明显好转，静脉输注抗胸腺细胞球蛋白75～100mg/d，使用5～7d，或给予血浆置换等治疗。经上述治疗后尿量较前增多，血肌酐水平下降，移植肾质地变软，无压痛，超声等辅助检查正常视为治疗有效。


　　五、结果


　　（1）肾脏移植术后患者一般资料分析：
　　随访6个月结束后，根据受者临床转归情况分组。其中，SF组421例，AR组33例。AR的发生时间为术后3～89d，发生时间的中位数为术后19d。
　　两组肾脏移植受者在性别、年龄、冷缺血时间、HLA错配数、免疫抑制剂方案等方面的差异均无统计学意义（P＞0.05）；
　　群体反应抗体（PRA）＜10%的患者与10%≤PRA≤30%的患者之间AR发生率的差异有统计学意义（P＝0.015）；
　　HLA抗原错配数≤2个以下抗原错配与3～4个抗原错配患者AR发生率的差异有统计学意义（x2＝7.432，P＝0.006）。


　　（2）T淋巴细胞亚群在肾脏移植受者术后AR治疗前后的变化：
　　AR发生时，外周血T淋巴细胞亚群可出现动态变化。外周血Cd4+T细胞百分比升高[（46.89±7.21）% vs （33.54±5.67）%，t＝8.169，P＜0.001]；Cd8+T细胞百分比下降[（18.63±4.25）% vs （28.11±5.97）%，t＝9.37，P＜0.001]，见图1。
　　在抗排斥治疗过程中，外周血T淋巴细胞各亚群也可出现动态变化。急性反应时Cd4+T/Cd8+T比值显著升高（2.81±0.85 vs 1.39±0.94，t＝7.336，P＜0.001），AR逆转后外周血Cd4+T/Cd8+T比值为（1.74±0.67），与AR发生时相比较低，差异有统计学意义（t＝7.597，P＝0.001）。





　　（3）B淋巴细胞亚群在肾脏移植受者术后AR治疗前后的变化：
　　与SF组比较，AR发生时外周血Cd3+Cd19+B细胞百分比升高[（15.79±3.53）% vs （10.2±3.04）%，t＝4.986，P＜0.001]，治疗稳定后，外周血Cd3+Cd19+B细胞百分比降至（9.18±2.89）%，与AR发生时相比，差异有统计学意义（t＝8.012，P＜0.001）。


　　（4）肾脏移植受者术后HLA抗体在AR治疗前后的变化：
　　对454例肾脏移植患者手术后进行了HLA抗体监测，术后初筛HLA抗体阳性率为21.4%（97例）。Ⅰ类抗体阳性率16.5%（75例），Ⅱ类抗体阳性率9.7%（44例），Ⅰ类Ⅱ类同时阳性率2.0%（9例）；其中DSA阳性率3.1%（14例）。治疗前抗体MFI均值为（7559±1496），治疗后为（3023±996），差异有统计学意义（t＝13.583，P＜0.001），且与同时期SF组相比，差异有统计学意义（t＝30.918，P＜0.001）。


　　（5）肾脏移植受者HLA抗体与AR的关系：
　　HLA抗体监测发现AR组和SF组DSA、NDSA抗体阳性率的差异有统计学意义（x2＝56.494，P＜0.001）。
　　根据病理组织活检结果对排斥反应的分类发现，16例AMR（急性抗体介导排斥反应）患者中DSA阳性7例，NDSA阳性9例，与CMR（急性细胞介导的排斥反应）患者中的比例相比，差异有统计学意义（x2＝13.232，P＜0.001）。
　　DSA-/NDSA-患者AR发生率为3.1%(11/357)，DSA-/NDSA+患者AR发生率为14.5%(12/83)，差异有统计学意义（x2＝15.372，P＝0.001）；DSA+/NDSA+患者AR发生率为71.4%(10/14)，与前两者相比差异有统计学意义(P＜0.001)。


　　六、讨论


　　AR是影响移植肾长期存活的独立危险因素。肾移植术后早期发生的AR以及未及时发现和处理的亚临床AR可导致移植肾逐渐丧失功能。因此早期发现并治疗AR是提高移植肾长期存活率的关键。根据发病机制，排异反应可分为细胞免疫介导的AR和体液免疫介导的AR。虽然至今有关排异反应的发生机制与详细过程尚未完全阐明，但目前公认的是，器官移植后所发生的AR是由T细胞介导的免疫应答反应引起的，它涉及细胞免疫和体液免疫、特异性和非特异性免疫等多种机制。
　　T淋巴细胞是免疫抑制剂作用的主要靶细胞，其数量和功能的变化反映了免疫抑制的程度。本研究结果表明，肾移植后发生AR时，外周血Cd3+Cd4+T细胞百分比升高，Cd3+Cd8+T细胞百分比下降，Cd4+T/Cd8+T比值升高，这与文献报道的结果一致。通过对AR组受者外周血淋巴细胞亚群的动态监测，我们发现当AR逆转后，Cd4+T/Cd8+T比值较发病时明显下降，表明监测机体T淋巴细胞亚群的变化不但对于AR的诊断有一定临床意义，而且可以作为判断抗排斥反应治疗的疗效和预后的参考指标之一。
　　B细胞主要介导体液性排斥反应，也可作为抗原提呈细胞参与细胞性排斥反应。对肾移植受者外周血连续动态监测显示，术后早期B细胞高度活化，表现为Cd19表达水平显著升高，这与术后超急性排斥反应和加速性排斥反应的发生时间相符合，提示肾移植术后早期机体处于体液免疫增强状态。本研究结果表明，肾移植受者发生AR时，外周血Cd3+Cd19+B细胞百分比明显升高，这与文献报道的结果一致。在AR逆转后，B细胞百分比较发病时明显下降，表明对B淋巴细胞比例的监测同样对AR诊断、抗排斥反应疗效、预后判断具有重要作用。
　　近年来，体液免疫因素在排斥反应中的作用逐渐受到重视。DSA是影响移植效果的重要免疫因素之一。Harmer等应用流式细胞技术检测法发现95%的发生排斥反应的患者体内存在DSA。一项大样本研究（826例器官排斥患者）表明，96%的患者被检测出DSA。本研究及前期研究发现66.7%（22/33）发生排斥反应的患者体内存在DSA或NDSA。HLA抗体阴性患者中AR发生率仅为3.1%（11/357）；DSA+/NDSA+患者AR发生率为71.4%（10/14），与DSA-/NDSA-患者患者及DSA-/NDSA+患者相比均有统计学差异。
　　本研究中，1例患者虽然DSA阳性但是肾功能一直正常，临床上没有排斥反应证据。根据文献报道，DSA阳性引发排斥反应的另一条件是，补体C1q及C3d水平升高。C1q水平与移植物微血管炎及组织中C4d沉积密切相关。DSA阳性且C1q阳性患者5年存活率仅54%，远低于HLA抗体阴性患者。C3d具有调节T、B细胞的功能，C3d的沉积常常与C4d同时发生，与肾移植、心脏移植的重症排斥反应密切相关，C3d+/DSA+受者发生移植器官损伤的风险大于C3d-/DSA+受者。由于条件限制，本研究没有监测患者C1q及C3d水平，推测这1例患者没有发生排斥反应的原因可能是DSA MFI值（3000）小于5000，C1q及C3d水平还不足以激活补体通路，导致组织损坏。
　　本研究对454例肾移植患者进行了淋巴细胞、DSA和NDSA免疫监测。其中T淋巴细胞监测主要用于辅助诊断细胞免疫介导的排斥反应；B细胞、DSA和NDSA监测主要用于辅助诊断体液免疫介导的排斥反应，其中DSA在2013年已被列入抗体介导排斥反应的诊断标准之一；NDSA也是导致抗体介导排斥反应一个非常重要的因素，目前是否将NDSA也纳入抗体介导的排斥反应诊断标准还在研讨中。另外，目前确实存在个别DSA和NDSA阴性的抗体介导的排斥反应，推测可能与主要组织相容性复合物Ｉ类相关链Ａ抗体和内皮细胞表面抗体相关，具体机制还在研究中。


　　总之，淋巴细胞亚群比例及DSA抗体的变化在肾移植术后排斥反应的发生过程中发挥重要作用，监测T、B淋巴细胞比例及DSA抗体水平的动态变化对于AR的诊断、疗效判定、预后有一定临床意义。

本文摘自于《肾移植术后早期淋巴细胞及DSA监测在诊断移植排斥反应中的意义》，仅供学习交流，完整准确内容请查阅原文。
原文作者：郑瑾，张江伟，王旭珍，匡陪丹，何晓丽，薛武军
作者单位：西安交通大学第一附属医院肾病医院肾移植科
原文来源：《山东大学学报（医学版）》 2017年7月 第55卷第7期