免疫组库测序在实体器官移植中的应用

大光

关于免疫状态的监测，淋巴细胞亚群、抗体、供者来源游离DNA等等这些还没搞明白呢，现在又来了个免疫组库测序，看看就好，不看也好吧。

免疫组库测序在实体器官移植中的应用
作者：梁厉飞1,陈婷婷2,杨橙1,3,
作者单位：1.复旦大学附属中山医院泌尿外科 上海市器官移植重点实验室机构；2.复旦大学附属中山医院药剂科；3.上海浦东复旦大学张江科技研究院
来源：《器官移植》2024年第2期

　　免疫组库包括个体循环中功能多样性T细胞和B细胞的多态性总和，反映出整体免疫反应的情况。随着测序技术的发展，免疫组库测序逐渐应用于研发疫苗、肿瘤免疫治疗、辅助诊断以及免疫相关疾病，包括器官移植相关领域的监测和研究。本文总结了近年来器官移植领域中免疫组库测序相关的研究和临床应用情况，旨在为进一步探索免疫组库测序作为移植后排斥反应无创诊断手段的价值以及规范标准提供参考。

1.　免疫组库测序应用于器官移植的必要性
　　排斥反应是实体器官移植术后影响移植物长期存活的主要因素，而能否在早期准确地诊断排斥反应的发生，是准确制定治疗方案、维持移植物功能的关键。目前临床上诊断器官移植排斥反应的金标准仍然是移植物活组织检查（活检），但因其侵入性，通常只在移植物功能出现异常且病因存疑时进行。供者来源性细胞游离DNA（dd-cfDNA）作为一种新型无创的生物标志物，在监测移植物预后和损伤方面已经表现出很大的潜力，然而，dd-cfDNA对T细胞介导的排斥反应（TCMR）和抗体介导的排斥反应（AMR）尚无法精确区分并且没有稳定的连续监测方案，目前不能在临床广泛开展。新型固相或细胞学抗人类白细胞抗原（HLA）抗体检测可以有效区分TCMR和AMR，但只有在损伤已经发生之后才能确认。利用超声造影结合携带特定抗体，如颗粒酶B（Granzyme B）抗体的微泡造影剂对移植物排斥反应的无创诊断也有了很多研究，但其精确性和普及性尚不能作为主要的辅助诊断标准。
　　基于目前的排斥反应监测手段，需要新的损伤小并且更精准的方法来帮助判断排斥反应的发生及其类型，以期在发生不可逆性损伤之前，尽早发现并及时做出干预。
　　免疫组库测序通过获取T细胞受体（TCR）和B细胞受体（BCR）的多样性总和，来全面评估免疫系统的情况。基于移植后排斥反应发生的原理，免疫组库测序有助于深入了解移植后免疫反应的情况。
　　排斥反应主要由T、B细胞介导发生。在移植早期，排斥反应首先由TCR结合供者HLA直接识别抗原启动，伴随着抗原提呈细胞识别并向T细胞提呈抗原的间接识别过程，长期的移植物排斥反应逐渐形成。无论是直接还是间接的抗原识别过程，都是通过TCR接收、传递信号，进而招募CD8+T细胞对移植物造成损伤。不仅如此，活化的辅助性T细胞（Th）向B细胞传递抗原信息，B细胞通过BCR接收抗原信号，从而加快成熟和分化，导致供者特异性抗体（DSA）的产生。在上述过程中，TCR和BCR的抗原识别是T、B细胞活化的关键步骤，TCR和BCR的多样性使获得性免疫系统能够对多种抗原刺激做出反应。
　　TCR和BCR的互补决定区3（CDR3）是决定抗原识别特异性的最可变基因区域。CDR3基因的多样性取决于可变（V）、多样性（D）和连接（J）基因片段的重组，以及基因的插入或缺失。TCR异源二聚体包括α链和β链，它们是通过a基因和b基因的随机重组而产生。TCR的多样性主要取决于TCRb基因重组，此过程是通过D-J重排后V-DJ重排的方式逐步发生的。BCR的多样性也是通过类似的方式产生的。
　　测序技术的进步使免疫组库在信使RNA（mRNA）和DNA水平上的检测和分析成为可能，并已被广泛应用，这也为准确诊断和监测器官移植术后排斥反应的发生提供了新的思路和方法，并可与现有多种无创诊断技术互补有无，极大地增加诊断效能。

2.　免疫组库在肾移植中的应用
　　免疫组库测序目前在肾移植中应用较多，特别是TCR测序。
　　张家兴等利用TCR测序对3例发生急性排斥反应的肾移植受者进行了观察和分析，全面地绘制了肾移植早期排斥反应的TCR CDR3免疫图谱，其中T细胞亚群中独特的CDR3以及TCR特征谱有助于评估急性排斥反应（AR）患者的免疫状态并指导临床及时对患者做出干预。
　　Aschauer等在一项前瞻性研究中利用TCR免疫组库测序分析了肾移植术后发生或不发生TCMR患者外周血中TCR克隆多样性以及效应性T细胞的变化。结果表明与移植前相比，移植后的TCR克隆型的整体数量并未出现明显变化，而效应性TCR的克隆型多样性却明显减少，并且效应性T细胞在发生排斥反应的移植肾中浸润明显增加。该研究也证明了外周血中TCR免疫组库可以反映移植肾中T细胞克隆表型的变化。其后续研究利用TCR免疫组库测序证明高致敏肾移植受者使用减量抗人T细胞免疫球蛋白诱导治疗可以起到与巴利昔单抗诱导相似的免疫抑制效果，保留了TCR免疫组库的多样性，降低了感染和肿瘤的易感性。
　　免疫组库的多样性是机体免疫系统可以对多种刺激做出反应的标志，并在多种自身免疫性疾病发生时多样性降低。肾移植术后T细胞数量的延迟恢复以及TCR多样性降低与移植术后感染和肿瘤发生风险增加有关，TCR测序提供了一种更直观的维度去观察移植前后TCR多样性及克隆丰度的变化。
　　Lai等利用TCR测序分析了移植前1d、移植后1d和移植后7d的TCR变化。研究发现与正常组相比，移植组的TCR多样性显著降低，并且移植组出现少量的高丰度克隆，而正常组中不存在高丰度克隆。结果表明，移植后1d可见T细胞耗竭以及TCR多样性降低，移植后7d TCR多样性有所回升但仍低于移植前1d。CDR3长度、VD和DJ插入长度在各时间点和移植受者之间差异均无统计学意义。该研究利用TCR多样性的减少描述了移植后免疫抑制的状态，但尚不能将其作为诊断的方式。
　　在感染新型冠状病毒的肾移植受者中，TCR免疫组库测序显示在不同的受者之间TCR的克隆有很大的差异，但在同一个体的不同器官中，TCR免疫组库的变化是一致的、均匀的，并且新型冠状病毒特异性TCR缺乏供者HLA限制性，表明感染新型冠状病毒并不会直接对移植肾造成损失，发展到肺炎阶段导致的移植肾功能障碍或失功可能是继发于全身强烈的炎症反应。
　　TCR测序可以检测克隆性CD8+T细胞对不同细胞性排斥反应产生的变化。
　　在移植后发生肿瘤的患者中应用抗程序性细胞死亡蛋白1（PD-1）治疗导致发生排斥反应时检测TCR组库的变化，发现了在这种环境下导致移植肾排斥反应发生的特异性CD8+T细胞亚群。
　　相比于肾活检，获取外周血更容易，并且外周血中的免疫细胞变化可以一定程度上反映移植物内免疫反应的情况，特别是在发生急性排斥反应时会伴随着T细胞比例的变化和极高的TCR翻转率，也体现出外周血TCR免疫组库测序可以作为移植前后排斥风险的预测指标之一。
　　Alachkar等在一项前瞻性研究中，收集了50例患者的样本，并对6例患者的血液和活检样本进行TCR测序，这6例患者中有2例在术后3个月内发生了TCMR。结果表明，与移植肾组织相比，血液中的TCR多样性更高，并且在发生TCMR的移植肾中排名前十的TCR克隆中，有至少6个克隆在早期便可以在血液中检测到，体现出其作为预测和诊断排斥反应发生指标的可能性。但发生排斥反应与非排斥反应患者的TCR整体多样性并没有表现出明显的差异。虽然这些研究中TCR免疫组库的量化指标受到不同的研究设计、分析方法以及样本数量较少的限制，但这些研究为TCR免疫组库测序应用于肾移植临床诊断提供了很好的借鉴。
　　同样的，很多研究致力于利用BCR测序分析去揭示排斥反应发生的更深层机制。根据排斥反应发生的免疫机制，类似于TCR，BCR在排斥反应发生时也会出现多样性减少，个别克隆型急剧扩增的现象。Pineda等在研究中利用BCR测序验证了这一点，并且研究还发现，BCR的多样性减少在排斥反应发生之前就已经能够观察到，说明了这一现象与排斥反应的发生可能存在因果关系。该研究中更值得注意的一点是在发生排斥反应的样本中，与驱动排斥反应过程相关的IGHV3-23等基因显著增加，更加说明BCR免疫组库测序在预测、指导治疗排斥反应方面具有重要的临床意义。
　　Wang等对术前1d、术后1d和术后7d共10例患者的外周血样本同时进行了TCR和BCR免疫组库测序，全面地概括了肾移植围手术期TCR/BCR CDR3免疫组库的特点。结果表明，与健康对照组相比，患者的TCR和BCR多样性降低，但差异无统计学意义；与术前相比，术后1d患者TCR和BRC的多样性有所下降，在术后7d有所上升。他们还发现无论是TCR CDR3还是BCR CDR3，部分CDR3克隆重叠序列的频率在移植受者中显著升高，并且确定了部分与移植免疫重建相关的TCR CDR3克隆序列。
　　由于体细胞高频突变和免疫球蛋白高变区域中点突变的累积在移植物中比在外周血中更多，所以通过外周血进行BCR免疫组库测序无法很全面地展示AMR所对应的BCR免疫组库图谱，这也导致单独使用BCR免疫组库测序诊断移植后排斥反应比较困难。但是BCR免疫组库测序仍然对早期抗原特异性有很大的价值，与TCR免疫组库测序结合分析可以更全面地了解早期排斥反应的情况，特别是在病理无法做出准确判断时。

3.　免疫组库测序在其他器官移植中的应用
　　免疫组库测序在其他实体器官移植中如肝移植、小肠移植和心脏移植等也开展了许多研究。
　　Yang等对6例肝移植受者移植前、移植后1d和移植后7d的外周血进行了TCR免疫组库测序，研究了肝移植前后和与健康对照组之间TCR免疫组库的动态变化和差异。CDR3和VD/DJ的序列长度在移植受者和对照组中相似，但移植受者的TCR多样性低于对照组，并且移植后7d与移植后1d相比多样性更低，这可能与新移植的肝脏和免疫抑制药的使用有关。其中，分别在移植前、移植后1d和移植后7d的最高丰度的克隆型在DNA和氨基酸序列之间几乎没有相似之处，但却出现了相同的V-J组合。
　　Savage等利用TCR β链的测序对8例肝移植受者的供者反应性T细胞克隆进行了跟踪，结果发现移植后6例患者的供者反应性TCR β序列显著减少，而在所有的8例肝移植受者中，供者反应性TCR β序列比其他序列的减少更明显。这些结果说明，TCR测序不仅可以确定肝移植后T细胞免疫组库的变化，还可以特异性地监测供者特异性克隆的强度，以指导后续治疗和了解预后。
　　虽然外周血的TCR测序可以更加方便地在一定程度上反映移植后免疫反应的情况，但移植肝TCR和BCR组库测序图谱显示，移植肝与外周血中T细胞亚群不同，仅在急性排斥反应中表现一致，在正常移植物或亚临床排斥反应中不一致，所以外周血TCR测序并不能完全反映移植肝内免疫反应的情况，BCR测序尚无研究有证据说明其有效性。因此移植肝活检T细胞免疫组库的变化能够更准确地了解移植后排斥反应的情况，也更具有特异性。
　　Zuber等详细地研究了小肠移植后受双向同种异体反应影响的移植物黏膜中受体来源T细胞的替换率。他们对7例小肠移植受者的18例活检样本进行了TCR CDR3测序分析，预先确定并追踪了供者反应性TCR，并且发现在移植物排斥反应发生时供者特异性克隆占受者来源T细胞的80%。这挑战了以往认为的在排斥反应发生时，大多移植物中浸润的淋巴细胞不是移植物特异性淋巴细胞的观点，因为高达80%的CD4+T细胞和CD8+T细胞克隆存在于经历早期TCMR的移植物中。
　　在心脏移植中，有研究将BCR测序应用于监测12例受者对免疫抑制的反应，其中有6例受者出现中至重度排斥反应。该研究首先描述了在没有发生排斥反应时免疫球蛋白重链（IgH）的特征，然后在移植后和免疫抑制6个月后进行IgH转录的检测，并将其归类为低表达和高表达转录。低表达的转录仅出现一种类型的Ig分子，可能由幼稚或不活跃的B细胞表达。高表达的转录可见多个分子表达，可能由活化的B细胞表达。虽然检测到的高表达IgH转录谱系的总数在各时间点没有发生变化，但高表达的IgA、IgE、IgG以及突变的IgM序列在更晚的时间点中的贡献相对于总的转录谱减少。基于此，研究者提出了活化的B细胞序列（ABS）即高表达的IgA、IgD、IgE、IgG和突变的IgM与总体序列的比值。ABS不仅与免疫抑制的程度呈反比，并且在心内膜活检和dd-cfDNA诊断为排斥反应时，其中位数增加了3倍。ABS可以比活检提前4个月发现排斥反应，体现了其诊断心脏移植早期排斥反应的潜力。
　　在一项手移植的病例报告中，Kim等利用高通量测序对移植手活检和外周血样本的TCR免疫组库进行了检测和比较，并且分析了移植物中浸润的淋巴细胞的情况。结果表明外周血中TCR克隆型虽然与移植物浸润的TCR克隆型有所差异，但变化趋势大体相同。其先前的研究提出，穿刺活检的结果不能完全代表移植手的免疫细胞浸润情况，而TCR免疫组库测序再次证明了这一点。

4.　免疫组库测序在器官移植感染中的应用
　　机会性病毒感染是实体器官移植中免疫抑制造成的严重并发症，并且也使患者更容易发生排斥反应。常见的病毒有BK病毒、巨细胞病毒（CMV）、爱泼斯坦-巴尔病毒（EBV）等。免疫组库测序有助于动态监测移植后感染的情况和风险，并且为进一步了解病毒感染影响排斥反应发生的机制提供了新的角度。
　　有研究利用TCR免疫组库测序，对11例CMV血清抗体阳性和HLA Ⅰ类不匹配但免疫风险较低的肾移植受者进行了分析。研究在外周血和移植肾中发现了与供者抗原和CMV发生交叉反应的T细胞及其克隆型，证明了这些交叉反应性克隆在CMV相关排斥反应发生机制中起到了关键作用。
　　在进行过继性T细胞治疗（ACT）治疗CMV感染的Ⅰ期临床试验中，应用TCR测序对治疗后的免疫组库的变化和影响进行了监测。结果显示ACT治疗有效的患者其TCR克隆偏向ACT中T细胞的克隆型或CMV特异性的T细胞克隆型，而对ACT无应答的患者的TCR免疫组库克隆型几乎没有改变。了解治疗前后免疫组库的变化为CMV细胞治疗的临床应用提供了好的平台和参考依据。
　　EBV是人体中最常见的病毒之一，在免疫功能低下的人群中会导致严重的感染甚至肿瘤。Nguyen等利用TCR免疫组库测序在感染EBV的肺移植受者中观察到移植前后EBV特异性CD8+T细胞克隆随时间的动态变化，并且提示了早期检测EBV特异性T细胞可以作为EBV血症的预测因子。
　　BK病毒感染和BK病毒性肾病是肾移植术后感染相关移植物失功的常见原因，目前活检仍是诊断BK病毒性肾病主要方法。Stervbo等利用TCR测序结合流式细胞技术开发了一种新的评估BK病毒感染的诊断工具。研究对7例感染BK病毒的肾移植受者的TCR免疫组库进行了分析，结果认为移植受者对BK病毒的清除与TCR克隆多样性和BK病毒特异性T细胞耗竭标志物相关。利用这一方法，他们对1例移植术后6周血清肌酐升高的活体肾移植受者进行了检测，发现BK病毒特异性TCR克隆大量扩增并占到整个免疫组库的81.6%，并根据这一结果制定了相应的BK病毒治疗方案，使得该受者情况改善并在之后的2年随访中肾功能保持稳定。

5.　小结
　　通过TCR和BCR免疫组库测序对免疫组库进行量化分析，可以从基因和细胞水平更直观地认识器官移植术后受者免疫状态的变化，有利于早期准确诊断排斥反应并及时做出针对性治疗。
　　目前，免疫组库测序在肾移植中应用最多，在肝移植、心脏移植中也已经开始应用。总体来说，移植术后TCR和BCR的多样性相对于移植前或健康人群减少，在发生排斥反应或者感染时，会出现多样性显著减少伴随着异常扩增的克隆型出现，不同的患者高丰度的克隆型可能相差甚远，但研究发现患者的反应性克隆之间存在着相同的重叠序列，这也为诊断和制定相应的治疗提供了依据。
　　虽然免疫组库测序已经逐渐在临床开展应用，但因检测数量少，缺乏大样本的队列研究，尚不能制定免疫组库测序对实体器官移植排斥反应的诊断标准。经济原因也不能忽视，在单个病例诊治中往往需要多次检测，期望未来能进一步降低检测成本。免疫组库测序已经开始在临床展现出它的准确性和预见性，能够通过特定的克隆型或预测因子在早期发现可能发生的排斥反应或感染，有望成为器官移植精准诊疗的有力武器。
（参考文献　略）

本文仅供学习参考，完整准确内容请查阅原始文献：梁厉飞,陈婷婷,杨橙.免疫组库测序在实体器官移植中的应用[J].器官移植,2024,15(2):207-213.
https://www.organtranspl.com/article/doi/10.3969/j.issn.1674-7445.2023192

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