人尿胰蛋白酶抑制剂对移植肾树突状细胞成熟的作用及其在肾移植排斥中的意义

大光

来源：中国优秀硕士学位论文全文数据库

人尿胰蛋白酶抑制剂对移植肾树突状细胞成熟的作用及其在肾移植排斥中的意义
【作者】 崔瀚文；
【导师】 蔡明；
【作者基本信息】 中国人民解放军医学院， 泌尿外科， 2013， 硕士

【摘要】

    器官移植已成为终末期脏器衰竭的最佳治疗方案，但排斥反应严重威胁着移植器官的功能和存活，是器官移植成功的最大障碍。在当前供体器官严重短缺的情况下，如何有效抑制排斥反应，保证移植物长期有功能存活、改善受者生活质量是器官移植领域亟待解决的问题。寻求更加高效、低毒、低感染、低致瘤危险性的特异性免疫抑制剂已成为当前移植免疫学界研究的重点。因此，我们有必要重新通过排斥反应发生机制去寻找干预的新靶点。

    肾移植过程中移植肾经历缺血、缺氧导致移植脏器的非特异性炎症损伤，通过“危险信号”激活固有免疫，促使树突状细胞（dendritic cell,DC）等抗原提呈细胞(antigen-presenting cells, APC)成熟，不仅分泌大量促炎细胞因子以激活更多的树突状细胞成熟，吸引其他炎症细胞浸润，同时导致DC表型改变、抗原提呈能力增强，当血流再通后，以DC为主的供者成熟APC与受者T细胞接触，通过直接识别模式激活受者T细胞，参与活化受者的适应性免疫系统，介导排斥反应发生。APC的活化是整个过程的核心，而目前的免疫抑制剂的作用主要是在针对排斥反应的效应性T细胞增殖阶段的干预，没有对抗原提呈细胞介导的T细胞活化阶段进行处理，因此我们尝试在此阶段进行干预。DC是目前所知的机体内功能最强的抗原提呈细胞、适应性免疫的启动者，是目前发现的唯一能直接激活初始型T细胞的APC。DC在摄取抗原或接受炎症因子刺激后活化成熟，高表达MHCII、共刺激分子CD80、CD86以及细胞间粘附分子，因而抗原提呈、免疫活化功能大大加强；其表面高表达趋化固子受体CCR6和CCR7，并分泌趋化因子、IL-12、TNF-α等促炎细胞因子，介导中性粒细胞及淋巴细胞浸润，加重组织损伤。

    蛋白酶抑制剂乌司他丁（Urinary Trypsin Inhibitor, UTI）具有很广的抑酶谱，能抑制胰蛋白酶、α-糜蛋白酶、磷脂酶A、透明质酸酶、弹性蛋白酶、纤溶酶等多种丝氨酸水解酶活性。此外，还能抑制心肌抑制因子的产生，改善微循环、稳定溶酶体膜，抑制溶酶体酶的释放、清除氧自由基、抑制炎症介质的释放等功能。临床上用于严重烧伤、菌血症、治疗急性胰腺炎、多器官功能衰竭。UTI不仅能够抑制多种蛋白酶的活性，减轻组织损伤，减少“危险信号”的释放，而且前期大量研究发现UTI可以抑制IL-12、TNF-α等促炎细胞因子的释放。上述两方面却又是诱导DC成熟不可或缺的因素，因此，我们推测UTI能够抑制DC成熟。

    本实验采用UTI处理DC，体外研究UTI对LPS介导肾脏DC成熟的抑制作用，并通过小鼠肾脏移植模型的体内研究进一步证实UTI对移植肾内DC的抑制作用并探讨其在减轻移植肾排斥反应作用的意义。

第一章：乌司他丁抑制LPS介导小鼠肾脏固有树突状细胞成熟

    目的：探讨UTI对LPS介导小鼠rDC成熟的抑制作用。

    方法：取C57BL/6J小鼠肾脏制备单细胞悬液，使用MACS（Magnetic Cell Sorting）磁珠分选CD11c+的rDC，流式细胞仪鉴定rDC纯度。LPS刺激24小时促使rDC成熟，给予不同浓度（0～00U/mL）UTI处理，ELISA检测上清液中IL-12的分泌水平；100U/mL的UTI处理后流式细胞仪检测rDC表面MHCII、CD80、CD86分子，以观察UTI对rDC表型及功能的影响；检测趋化因子受体7（chemokine receptor7, CCR7）的表达，计数受巨噬细胞炎症蛋白3β(Macrophage inflammatory protein3β,Mip-3β)趋化进入细胞培养小室下层的CD11c+细胞数目，分析UTI对rDC趋化能力的影响。

    结果：LPS刺激促使rDC成熟，高表达MHCII、CD80、CD86分子并分泌大量IL-12，而UTI能够抑制LPS介导表型和功能成熟。经UTI处理CCR7分子的表达以及受趋化的CD11c+细胞数目显著降低，表明可以抑制LPS介导的趋化能力上调。

    结论：UTI能够抑制LPS介导的小鼠肾脏树突状细胞成熟和趋化能力上调。

第二章：小鼠肾脏移植模型的建立

    目的:建立小鼠肾脏移植模型，为后续体内实验提供支持。

    方法：以C57BL/6(H-2b)小鼠建立同系肾脏移植模型，共30对。戊巴比妥钠按50mg/kg进行腹腔注射麻醉。供体手术：取腹部大十字切口入腹，将肠道移向右侧，充分显露左肾。4根8-0线分别于肾血管水平上下分别结扎腹主动脉及下腔静脉，经腹主动脉灌注肝素盐水至肾脏成土黄色，在肾静脉与下腔静脉连接处剪断肾静脉、肾动脉下方2mm倾斜剪断腹主动脉，取出肾脏放入4°C冰箱。受体手术：切除小鼠右肾，采用供者腹主动脉瓣对受者腹主动脉、供者肾静脉对受者下腔静脉端侧吻合。移植肾脏迅速变为粉红色。将移植肾输尿管拉入受者膀胱，输尿管固定于膀胱，关闭腹腔。4-7天后麻醉下摘除左肾，受者完全靠移植肾存活。

    结果：供者手术时间28.1±3.2min，受者阻断血流时间31.3±3.5min,受者整体手术时间58.5±8.5min。30例手术成功21例，成功率70.0%。失败的原因：移植肾灌注不良，深静脉血栓形成及受者不能耐受肾移植手术或二次手术。

    结论：我们成功建立小鼠肾脏移植模型，为后续实验提供支持。

第三章：乌司他丁抑制移植肾树突状细胞成熟减轻移植肾排斥反应

    目的：探讨UTI减轻小鼠肾移植后排斥反应的作用及机制。

    方法：以Balb/c (H-2d)为供者，C57BL/6(H-2b)为受者，制备小鼠肾移植模型。Sham组为空白组（Balb/c (H-2d)），不进行肾移植也不给予UTI预处理；T组只进行肾移植，不接受UTI预处理；UT组受鼠进行肾移植并且接受UTI预处理。术后检测各组受鼠的血清肌酐（Serum creatinine,SCr）水平，观察各组移植肾组织病理改变，分析UTI对肾功能及急性排斥反应的发生。移植后24h通过RT-PCR检测IL-6、IL-10、IL-17及TNF-α的表达以观察移植肾的免疫状态；流式细胞仪检测DC表面MHCII、CD80、CD86分子，以观察UTI对DC成熟的影响。

    结果：术后，UT组与T组受鼠SCr水平有所升高，但UT组始终保持在较低水平（P <0.001）；与Sham组相比，T组受鼠的移植肾弥漫浸润单个核细胞，而UT组移植肾单个核细胞浸润情况较T组明显减轻，肾小球及肾小管形态大致正常，表明UTI能够减轻急性排斥反应，提高移植肾功能。移植后24h，UTI显著抑制移植物内IL-6、IL-17及TNF-α的mRNA表达并提高IL-10的表达(P <0.001)；T组较Sham组移植肾内DC表面高表达MHCII、CD80、CD86分子，而UT组MHCII、CD80、CD86的表达较T组明显减少(P <0.001或P <0.01)，表明UTI能够抑制DC成熟，进而改善受体的免疫状态。

    结论：UTI减轻同种异体肾移植小鼠的排斥反应，改善移植肾功能，其机制可能是：1）抑制移植肾DC成熟，2）降低促炎细胞因子的表达，3）减轻炎症细胞的浸润；三者间可能存在相互促进的关系。