Cylex ImmuKnow法检测细胞免疫功能及在肾移植中临床应用研究

小白鼠

       Cylex ImmuKnow(ImmuKnow)法是唯一得到FDA认可的检测移植受者应用免疫抑制剂时细胞免疫(CMI)功能的方法。它直接反应细胞免疫的功能，针对免疫抑制用药环节，24小时之内可出结果，而且结果量化，是目前检测移植术后病人的免疫状态，指导用药的较好指标。但是，作为一项新的免疫学评价指标，ImmuKnow法尚需在大范围、大样本量中验证与完善，尚需验证其是否符合中国人群的种族遗传背景。Alemtuzumab作为耗竭性抗体，可用于肾移植术前诱导治疗。但在肾移植领域尚缺乏该耗竭性诱导疗法对细胞免疫功能影响的相关研究。
　　 目的：本实验采用Cylex ImmuKnow免疫细胞功能监测仪通过生物发光法测量植物血凝素刺激后全血CD4+T细胞ATP量的变化，以监测肾移植受者手术前后细胞免疫状态的变化，以及移植术后稳定、排斥、感染等状态患者的ImmuKnow ATP值，了解移植受者术后细胞免疫状态的变化情况及在预示排斥反应、感染等不良事件中的作用。本课题旨在探讨ImmuKnow法在临床应用的可行性及其在评估肾移植术后免疫状态、指导临床用药和实施个体化免疫治疗中的作用；试图建立符合中国人群种族遗传背景的移植受者目标免疫反应区；并研究耗竭诱导抗体Alemtuzumab对细胞免疫功能的影响。
　　 方法：2008年10月～2010年3月期间在南京军区福州总医院泌尿外科选取尿毒症及肾移植术后患者259例，取得血液标本881份。肾移植术后应用常规3联免疫抑制方案：激素+CNI(CsA或FK506)+MMF，部分患者应用Alemtuzumab耗竭诱导疗法。ImmuKnow法检测时间为定期检测(术前、术后15、30、60、90、180天)与非定期检测(不良事件干预前、后，门诊随访或再次入院期间的检测)。分组：1、按不同状态分组：稳定组(常规稳定组；CAMPATH稳定组；总体稳定组)、0d组、感染组、排斥组、MP组。2、重复测量分组(采用重复测量设计，术后14、30、60、90、180天分别检测，临床状态稳定)：常规组、CAMPATH组。ImmuKnow法检测流程为：1、细胞刺激，2、CD4细胞选择和ATP释放，3、ATP测量，4、数据分析与结果计算。统计学分析：非正态分布资料采用非参数检验：Kruskal-Wallis检验各组间差异，Nemenyi检验各组间两两比较。ROC分析评价诊断的准确性。重复测量设计资料应用重复测量方差分析。
　　 结果：
　　 不同状态分组组间比较结果为：1、无论以人数计或以标本数计：常规及总体稳定组分别与0d组：P＞0.05，差异无统计学意义；常规及总体稳定组分别与感染组：P＜0.001，差异有统计学意义，感染组ATP值较小；常规及总体稳定组分别与排斥组：P＜0.001，差异有统计学意义，排斥组ATP值较大；0d组与感染组：P＜0.001，差异有统计学意义，0d组ATP值较大；0d组与排斥组：P＜0.001，差异有统计学意义，0d组ATP值较小；感染组与排斥组：P＜0.001，差异有统计学意义，感染组ATP值较小。2、以人数计： CAMPATH稳定组与常规稳定组：P＜0.001，差异有统计学意义，CAMPATH稳定组ATP值较小；CAMPATH稳定组与0d组：P＜0.001，差异有统计学意义，CAMPATH稳定组ATP值较小；CAMPATH稳定组与感染组：P=0.079，差异无统计学意义；CAMPATH稳定组与排斥组：P＜0.001，差异有统计学意义，CAMPATH稳定组ATP值较小；CAMPATH稳定组与MP组：P=0.82，差异无统计学意义；MP组分别与常规及总体稳定组：P＜0.001，差异有统计学意义，MP组ATP值较小；MP组与0d组：P=0.002，差异有统计学意义，MP组ATP值较小；MP组与感染组：P=0.011，差异有统计学意义，MP组ATP值较大；MP组与排斥组：P＜0.001，差异有统计学意义，MP组ATP值较小。
　　 不同状态分组ROC分析结果为(无论以人数或以标本数计，无论稳定组是否包含CAMPATH稳定组，无论诊断感染或排斥)：1、各诊断界值的ROC曲线下面积均＞0.95(P＜0.001)；2、正确指数最大的点作为诊断界值，其正确指数均大等于FDA推荐界值。取常规稳定组，以人数计为代表：以150ng/mL(特异度最高)、225ng/mL(FDA推荐)、238ng/mL(正确指数最大，灵敏度最高)分别作为感染界值；以482ng/mL(正确指数最大，灵敏度最高)、525ng/mL(FDA推荐)、594ng/mL(特异度最高)分别作为排斥界值。通过比较诊断界值的上述指标，尤其是正确指数，提出以238ng/mL作为感染界值，以482ng/mL作为排斥界值。推荐华人肾移植目标免疫反应区为239～481ng/mL，相比FDA推荐的目标免疫反应区(226～524ng/mL)具有更准确的诊断效果，且符合中国人群的种族遗传背景，并具有器官(肾脏)特异性。
　　 重复测量分组结果为：共66例，其中常规组55例，CAMPATH组11例。球形度检验：P=0.355，说明患者各检测时间点的ATP水平不具相关性。主体内效应的检验：时间与分组之间不存在交互作用；时间对ATP水平的影响不具统计学意义。主体间效应的检验：分组P＜0.001，不同分组之间的ATP差异有统计学意义。两组各时间点的比较：术后14、30、60、90、180天，均P＜0.05，两组差异均有统计学意义，常规组ATP均高于CAMPATH组。由轮廓图可见：两组边际均值斜率在14～30天及90～180天相似；30～60天相反；60～90天CAMPATH组斜率明显高于常规组。在本实验样本中：与常规组不同，CAMPATH组的ATP水平在30～60天仍然下降，在60～90天升幅明显较大。
　　 结论：
　　 1.Cylex ImmuKnow法可区分肾移植适合术后不同临床状态(稳定、排斥、感染)的CMI状态差异。
　　 2.推荐华人肾移植目标免疫反应区为239～481 ng/mL。
　　 3.临床状态稳定者，CMI状态无差异；但接受Alemtuzumab耗竭诱导治疗的临床状态稳定肾移植受者CMI状态水平较低。
　　 4.临床稳定肾移植受者，术后180天内的CMI状态不随时间推移而改变。
　　 5.Alemtuzumab耗竭诱导治疗之后的临床稳定受者，其CMI状态与临床感染受者以及急性排斥反应并应用大剂量激素冲击治疗之后受者类似。但是感染受者与急性排斥反应并应用大剂量激素冲击治疗之后受者CMI状态有差异。
　　 6.Alemtuzumab耗竭诱导对CMI状态影响效果维持至少180天。本实验样本中：Alemtuzumab耗竭诱导在约30～60天内对CMI状态产生持续的负面影响，60～90天开始失效。
　　 7.可单以Cylex ImmuKnow法为基础，构建临床免疫监测实验室，为移植临床提供风险评估，个体化患者诊疗。

                  （本文是第二军医大学硕士研究生周浩申请硕士学位的论文）