肾移植后抗体介导的排斥反应的临床病理特征及个体化免疫治疗研究

大光

肾移植后抗体介导的排斥反应的临床病理特征及个体化免疫治疗研究
作者：王光策 王锁刚 陈铸 崔勇 何伟 张缠 陈杰 张翥
作者单位：河南中医学院第一附属医院泌尿外科肾移植科
来源：《器官移植》 2015年7月 第6卷第4期


    随着抗体检测技术的不断发展和供体特异性抗原(DSA)、C4d等抗体介导免疫损伤标志物的发现，人类白细胞抗原(HLA)抗体和非HLA抗体在急性排斥反应中的作用越来越受到人们的重视。抗体介导的排斥反应(AMR)又称为体液性排斥反应(HR)，是由HLA分子、血ABO同种凝集素或内皮细胞抗原抗体介导的一类排斥反应。在早期急性抗体介导的排斥反应(AAMR)及慢性活动性抗体介导的排斥反应(CAMR)过程中，高效价的抗体导致补体系统的激活和移植物内皮组织的溶解性损伤。临床上表现为病情严重、进展迅速、移植肾功能进行性减退，临床诊治困难，对肾上腺皮质激素(激素)冲击治疗效果差，常常导致移植肾失功率增加，严重威胁患者及其移植肾的远期存活率。因此，早期采取积极有效的治疗策略对挽救移植肾功能有重要意义。本研究通过探讨AMR的临床病理特征及早期个体化免疫治疗策略，并评价其疗效，旨在为AMR的早期、准确、个体化诊治提供参考和借鉴，从而提高AMR患者及移植肾的长期存活率。

1 资料与方法

1.1 抗体介导的排斥反应的诊断标准

    参照Banff2009分类标准，AMR诊断标准需具备以下条件：(1)临床表现为肾功能迅速下降，激素治疗无效；(2)组织病理学特点为肾小管周围毛细血管(PTC)、肾小球和肾小管的中性粒细胞浸润，小动脉和肾小球血管的纤维素样坏死，肾小球的纤维素血栓形成，急性肾小管坏死(ATN)；(3)C4d在PTC内皮广泛沉积；(4)患者体内检测到DSA。

1.2 纳入和排除标准

    2010年1月至2013年12月，在河南中医学院第一附属医院泌尿外科肾移植科确诊为AMR的患者，按下列纳入和排除标准人组。

    纳入标准：(1)具有排斥反应的临床表现；(2)经过移植肾穿刺活组织检查(活检)，具有典型的组织病理学特点；(3)发生排斥反应时患者血清中检测到或未检测到DSA；(4)能耐受并接受系统治疗者。

    排除标准：(1)符合上述诊断标准，但合并感染；(2)伴心、脑血管，肝脏和造血系统等严重危及生命的原发性疾病患者；(3)过敏体质或治疗期间有药物及食物过敏史；(4)因各种原因不合作，不能坚持治疗者。

1.3 研究对象

    纳入肾移植患者32例，其中男22例，女10例；平均年龄(39±10)岁。首次移植26例，二次移植6例。供受者ABO血型相符，均进行严格的HLA配型，HLA6个位点错配1～3个，补体依赖淋巴细胞毒性试验(CDC)＜5%；移植前群体反应性抗体(PRA)≤10% 24例，11%～50% 7例，＞50% 1例；发生排斥反应时PRA≤10% 19例，11%～50% 8例，50%～80% 3例，＞80% 2例。供肾热缺血时间5～10min，冷缺血时间不超过24h。肾移植手术方式为供肾静脉与患者髂外静脉行端侧吻合，供肾动脉与患者髂外动脉或髂内动脉吻合，供肾输尿管与患者膀胱行隧道式乳头状吻合。所有患者资料均来自河南中医学院第一附属医院肾移植随访登记系统。所有患者及家属对治疗方案均完全知情同意，在充分了解治疗方案的前提下签署“知情同意书”；肾移植手术及治疗方案均获该院器官移植伦理委员会批准。

1.4 免疫诱导及免疫抑制治疗方案

    肾移植术中及术后应用抗胸腺细胞球蛋白(ATG)免疫诱导者23例，分别给予0.75～1.5mg/(kg·d)，连用3～5d；巴利昔单抗诱导者9例，术前及术后4d分别给予巴利昔单抗2Omg。所有肾移植患者术后均联合环孢素(CsA)或他克莫司(FK506)+吗替麦考酚酯(MMF)或麦考酚钠肠溶片(EC-MPS)+激素三联免疫抑制方案，其中CsA起始剂量为5～6mg/(kg·d)，FK506起始剂量为0.10～0.15mg/(kg·d)，以后根据血药浓度调整药物剂量；MMF 1.5～2.0g/d，EC-MPS 1080～1440mg/d；术中和术后3d应用甲泼尼龙6～8mg/(kg·d)，术后4d起改口服泼尼松20～25mg/d。

1.5 治疗方法

    确诊后，分析不同患者的病因及临床病理特征，采取个体化的免疫干预措施：(1)应用以MMF、FK506和泼尼松为基础的三联免疫抑制方案，根据血药浓度适当调整药物剂量；(2)对早期AAMR及合并急性T细胞性排斥的CAMR患者，予以甲泼尼龙0.25～0.50g/d冲击治疗3d，ATG 5O～100mg/d治疗7～10d；(3)少尿或无尿患者，采取间断性血液透析(IHD)治疗；(4)对CAMR患者，予小剂量甲泼尼龙(40～80mg/d)联合ATG 50～100mg/d治疗5～7d；(5)静脉注射用免疫球蛋白(IVIG)1.0g/kg，分2～3次静脉滴注；(6)高致敏患者，除应用上述方案，还根据PRA水平进行免疫吸附(IA)或血浆置换(PE)治疗1～3次。

1.6 观察指标

    所有患者均检测外周血中供体特异性HLA抗体，治疗前及治疗后留取血标本测定血尿素氮(BUN)、血清肌酐(Scr)、PRA和血清免疫球蛋白(Ig)G、IgA、IgM，并密切观察不良反应。治疗1年后评价疗效，继续随访观察临床转归，随访至2015年2月。

1.7 疗效评价

    AMR治疗成功的标准为移植肾功能恢复正常，且无严重并发症。疗效评定主要依据肾功能改变：(1)完全缓解：治疗1周后Scr水平下降并逐渐降至排斥反应发生前水平，且随访1年肾功能稳定；(2)部分缓解：治疗1周后Scr水平下降但未能降至排斥前水平或Scr水平一度降至排斥前水平，但随访1年Scr水平上升；(3)无缓解：Scr水平无下降。

1.8 统计学方法 略

2 结果

2.1 临床特点

    32例患者中，早期AAMR 18例，发生在术后1个月内4例，2～3个月5例，3～6个月7例，7～12个月2例；其临床表现主要为少尿或无尿，移植肾功能迅速减退，大剂量激素冲击治疗效果差。CAMR 14例，发生在术后6～12个月3例，13～36个月5例，37～72个月6例，临床表现为短时间内Scr进行性升高，或者“爬行肌酐”，伴或不伴蛋白尿，调整免疫抑制药物及剂量无效。

2.2 组织病理学特征

    早期AAMR的主要病理表现为ATN样改变，管周毛细血管炎及小球炎，动脉纤维素样坏死，C4d在PTC呈线性沉积，免疫球蛋白或C3在动脉壁沉积；CAMR的病理表现为肾小球病样改变，PTC基底膜分层，动脉内膜纤维增厚，C4d在PTC弥漫沉积，见图1。本组6例CAMR患者的C4d染色阴性。



2.3 供体特异性抗体检测结果

    13例PRA阳性患者进行抗体特异性分析，结果8例(62%，8/13)为供体特异性HLA抗体，5例(38%，5/13)为非供体特异性抗体。供体特异性HLA抗体阳性组中，4例(4/8)只有HLA I类抗体，2例(2/8)只有HLA Ⅱ类抗体，2例(2/8)则同时有两类抗体。8例供体特异性HLA抗体阳性患者中有3例发生AAMR，5例发生CAMR，其中2例反复治疗无效，分别于免疫治疗后1、3个月时移植肾功能丧失，另有3例持续存在CAMR，出现移植肾功能减退。

2.4 免疫治疗对肾功能、PRA和血清免疫球蛋白IgG、IgA、IgM的影响

    根据移植肾临床病理表现，分别给予32例AMR患者个体化的免疫干预治疗。与治疗前比较，AAMR及CAMR患者治疗后的BUN、Scr水平均明显降低(均为P＜0.01)，治疗后PRA和IgG、IgA、IgM水平明显降低(均为P＜0.01)，见表1。



2.5 临床转归

    全部患者接受系统随访12～72个月，其中20例(63%)于治疗后1个月内肾功能逐渐恢复正常，平均恢复时间为24d；7例(22%)Scr维持在200～300μmol/L，病情稳定；5例(16%)Scr呈缓慢上升趋势，其中2例(6%)回归备注透析，3例(9%)仍在维持治疗，尚不需透析治疗。至随访终点时，无1例患者死亡。

2.6 不良反应

    32例患者中有1例在治疗期间外周血白细胞计数下降，但程度较轻，调整免疫抑制剂用量，应用升白细胞药物等处理，白细胞恢复正常，不影响治疗。其余患者在治疗期间未见明显不良反应，无严重感染性并发症发生。

3 讨论

    由于AMR的起病隐匿，早期临床表现不典型，导致临床诊断相对滞后，而经验性治疗往往贻误了治疗的最佳时机。虽然移植肾穿刺活检为有创性检查，但仍是目前诊断AMR的金标准，且在预测移植肾的长期预后、研究移植肾病变的病理机制、指导临床治疗等方面，具有不可替代的作用。在AMR的诊断、分级和分期上面临的最大挑战是AMR的病理学特征随移植术后时间的推移而变化，且在不同肾移植患者间存在较大的个体差异性。因此，AMR的分类和病理诊断标准在不断地更新，2013年Banf会议确定AAMR的诊断需满足以下特征：(1)急性组织损伤的病理学依据：微血管炎、内膜或跨膜性动脉炎、血栓性微血管病(TMA)、ATN；(2)有预存或新发抗体与血管内皮细胞相互作用的证据，PTC部位C4d弥漫的线性沉积，中度的微血管炎；(3)血清学有DSA证据(HLA或其它抗原)。CAMR应满足以下特征：(1)慢性组织损伤的病理学依据，包括移植肾肾小球病样改变、严重的PTC基底膜分层、新出现的动脉内膜纤维化；(2)有预存或新发抗体与血管内皮细胞相互作用的证据，PTC部位C4d弥漫性线性沉积，中度的微血管炎症，内皮活化和损伤的转录表达增加或病理活检证实内皮损伤的基因表达标记物增加；(3)外周循环中出现有针对DSA的血清学证据。C4d系补体成分C4经过激活后的裂解片段，C4d在移植肾PTC沉积被认为是补体在参与免疫反应的部位所遗留下来的“指纹”，是患者体内发生AMR的免疫学证据。既往认为C4d染色阳性是AMR的最强的原位证据，但近年来研究已明确C4d在诊断AMR上具有局限性，C4d可能出现假阳性，同时也存在C4d阴性的AMR。此外，T细胞介导的排斥反应(TCMR)也可表现C4d在PTC沉积，且与移植肾预后密切相关。本组AMR患者中有26例C4d在移植肾PTC呈线性沉积，而其余6例C4d染色为阴性，提示我们重新认识C4d在AMR诊断中的作用和地位是十分必要的。

    DSA是指患者接受组织或器官移植后体内产生的针对供体抗原的特异性抗体，主要包括HLA抗体和非HLA抗体[如抗内皮细胞抗体、抗波形蛋白抗体、抗主要组织相容性复合体I类相关链A(MICA)抗体和抗主要组织相容性复合体I类相关链B(MICB)抗体等]。目前临床关注的重点主要集中在供体特异性HLA抗体，文献报道中有关DSA大多数是指HLA抗体。我们在随访中发现，8例供体特异性HLA抗体阳性患者中有3例发生AAMR，5例发生CAMR，其中2例移植肾失功，3例持续存在CAMR，导致患者移植肾的长期存活率明显下降。这说明供体特异性HLA抗体在AMR发生中占据着主导地位。能否去除该抗体或抑制其继续升高是免疫干预的主要目的，也是改善移植肾预后的必要条件。

    据我们的观察，早期AAMR多发生在肾移植术后6个月内，少数发生在6个月～1年，其主要表现为少尿或无尿，移植肾功能迅速减退，大剂量激素冲击治疗效果差。CAMR发生在肾移植术后6个月～6年，临床表现为短时间内肾功能进行性恶化，伴或不伴蛋白尿，调整免疫抑制剂及剂量无效。AAMR与CAMR的时间界限不十分清楚，临床表现均为病情危重，移植肾功能减退，但移植肾组织病理学表现各有特点。可见，临床鉴别和诊断AAMR与CAMR，除了检测移植肾功能，还要结合肾移植患者血清供体DSA、移植肾病理活检表现及C4d染色结果予以综合判断。

    AMR的治疗策略包括：(1)抑制T细胞，如应用抗淋巴细胞抗体、钙神经蛋白抑制剂、MMF等；(2)循环抗体的清除，如PE或其他免疫吸附方法；(3)抗体封闭治疗，应用IVIG；(4)抑制或者清除B细胞，如应用利妥昔单抗等。孙启全等对160例肾移植患者中符合AMR诊断的10例患者立即给予FK506联合MMF治疗，并进行连续性血液净化，在治疗4～26d后，患者均出现尿量增加，肾功能逐渐恢复正常，提示该法也有一定疗效。我们借鉴了上述治疗策略，同时结合国内外文献报道的治疗经验，制定以MMF、FK506和泼尼松为基础的免疫抑制方案，并根据患者的临床和病理特征进行调整，采取个体化的免疫干预措施。其中抗淋巴细胞抗体、PE或IA、IVIG等干预措施发挥了积极的作用，患者经治疗后PRA、血清免疫球蛋白水平均明显降低，高致敏患者的免疫状态和移植肾功能得到显著改善，取得了良好的临床效果。然而，我们也发现因抗体介导移植肾血管损伤的严重程度不同，疗效也不尽相同。若肾小球病样改变和小血管损伤较轻，仅表现为内皮炎症和少量微血栓，则预后良好；若病理表现为移植肾小球内广泛微血栓形成或小血管的纤维素样坏死，则预后较差。

    综上所述，我们认为移植肾病理活检是AMR诊断的金标准。在肾移植患者中进行程序性移植肾病理活检，不仅有利于客观评价AMR的发生率，而且可根据不同的病理学特点，指导临床采取个体化的综合性免疫治疗策略，调整和优化免疫抑制方案，切实改善移植患者的长期预后，降低AMR造成的移植肾失功率。此外，术前应重视供受者HLA配型，有效预防供体特异性HLA抗体的产生，对降低AMR发生率有重要意义。目前我们对AMR的认识还不尽完善，AMR的发生机制及规范化治疗亟待于进一步深入研究和探索。

参考文献 略