实体器官移植受者的免疫功能测定研究进展

大光

实体器官移植受者的免疫功能测定研究进展
作者：吕海金 综述；易慧敏 审校
作者单位：中山大学附属第三医院肝移植中心 中山大学器官移植研究所 广东省器官移植研究所
来源：《器官移植》 2014年7月 第5卷第4期


    新型免疫抑制剂的发现及有效综合治疗水平的不断提高，受者的生存率得到显著提高。然而，移植后免疫相关的并发症仍是移植领域的难题。目前临床上主要根据免疫抑制剂剂量和血药浓度监测来调整免疫治疗方案。但是并非所有免疫治疗剂都能进行血药浓度监测，而且个体免疫系统对药物敏感性的差异以及药物之间的相互作用，均会导致血药浓度甚至药代动力学指标无法真实反映患者免疫状态水平，进而导致药物不良反应的发生。我们在临床实践中也可观察到，使用完全相同免疫抑制方案的患者出现排斥反应或其他并发症的情况却不一致，因此测定受者的免疫功能更为重要。

    根据抗原类型不同，移植后受者的免疫功能测定大体可分为供体抗原特异性和非特异性免疫检测。前者是理想的排斥反应预测指标，如移植前补体依赖淋巴细胞毒性试验。后者是通过多克隆刺激因子(如植物凝集素、伴刀豆蛋白A等)作用于淋巴细胞，观察其活化、增殖能力，除了预测排斥反应，更适用于预测临床上免疫抑制过度的相关风险(如感染、肿瘤)。近10年来移植免疫功能测定研究热点主要集中在T淋巴细胞相关功能和药物修饰等相关生物学标记的检测，本文就这两方面的研究进展作一综述。

1  T淋巴细胞相关功能的测定

1.1 T淋巴细胞计数及其亚型

    器官移植术后的免疫抑制剂主要作用于受体的T淋巴细胞的活化和克隆增殖阶段，最终影响T淋巴细胞的数量和T、B淋巴细胞的功能。

1.1.1 CD4+T淋巴细胞计数  CD4+T淋巴细胞大部分为辅助性T(T helper，Th)细胞，是体液免疫和细胞免疫的启动者。抗胸腺细胞球蛋白(ATG)与T淋巴细胞表面结合，使其表面受体失去识别抗原的能力，同时在补体参与下溶解淋巴细胞。尽管ATG使用时间不长(一般不超过4d)，但对CD4+T淋巴细胞数目影响可能持续数年。CD4+T淋巴细胞减少会增加恶性肿瘤和机会性感染的几率，并与肾移植远期死亡率相关。

1.1.2 CD4+/CD8+T淋巴细胞比值  目前认为CD8+T淋巴细胞是抑制性T淋巴细胞，能抑制Th细胞功能、参与免疫耐受形成，与CD4+T淋巴细胞的免疫调节作用截然相反，因此CD4+/CD8+T淋巴细胞比值亦用于移植后免疫功能判断。当淋巴细胞增生受到抑制时，CD4+/CD8+T淋巴细胞比值可能变异较大，应注意结合其他监测指标进行分析。

1.1.3 辅助性T细胞/调节性T细胞  Th细胞参与宿主抗移植物的排斥反应，而调节性T细胞(Treg)则参与诱导免疫耐受。迄今为止发现与移植相关的Th细胞包括Th1、Th2、Th9、Th17、Th22、滤泡性Th细胞等。通过树突状细胞的抗原提呈作用，在不同细胞因子作用下，幼稚CD4+T淋巴细胞分化为上述不同Th细胞，并分泌不同的细胞因子参与排斥免疫反应。近年来，CD8+CD28-Treg和CD4+Foxp3+CD25high Treg在免疫耐受中的作用研究早已成为热点，后者已逐渐应用于临床。利用流式细胞技术分离出各亚型T淋巴细胞并计数，可用于预测临床预后和指导免疫抑制剂治疗。

1.2 T淋巴细胞内三磷腺苷水平

    ImmuKnow Assay是目前美国食品和药品管理局(FDA)批准的唯一一种有商业价值的免疫功能检查方法。在体外丝裂原刺激下，全血经15～18h的细胞孵化，再经单克隆抗体刺激筛选出CD4+T淋巴细胞，溶解细胞后采用荧光化学反应检测细胞内三磷腺苷(iATP)合成水平。由于iATP是通过全血检测T淋巴细胞活化早期的能量水平，被认为是反映细胞免疫总体功能指标之一。国内外已有大量研究表明iATP在评估免疫状态、预测排斥反应或过度免疫风险方面具有一定的价值，在免疫系统不完善的儿童中尤为适用。根据iATP水平将免疫功能分为强(≥525μg/L)、中等(226～524μg/L)、弱(≤225μg/L)3个等级。Kowalski等对美国10家移植中心的数据进行Meta分析得出，临床证实为排斥反应的患者中，iATP水平的中位数达488μg/L，感染患者则低至111μg/L，如果需要达到免疫稳态，建议将iATP水平控制在130～450μg/L。由于受体的个体免疫基础和接受器官移植种类的差异，且iATP水平只能反映静态单个时间点的免疫状态，因此单独检测iATP水平并不能有效预测感染或排斥反应的风险，需结合更多的指标综合判断。

1.3 T淋巴细胞活化和增殖标志物

    CD30是一种属肿瘤坏死因子(TNF)/神经生长因子受体家族的跨膜糖蛋白，分子量约120kD，性质相对稳定，能反复冻融，可作为临床上监测排斥反应的指标。CD30最初在霍奇金淋巴瘤组织中的镜影细胞细胞膜表面发现其表达的抗原。血液中可溶性CD30分子(sCD30)来源于活化的CD30+T淋巴细胞的释放。Martinez等研究发现，不同于CD3-/CD28-介导的刺激，CD30+T淋巴细胞是接触同种抗原后释放细胞因子最多的T淋巴细胞，因此它在同种移植中起重要作用。后来，Gaspal等报道CD30表达缺陷的小鼠缺乏记忆性CD4+T淋巴细胞和记忆性抗体。Dai等发现CD4+/CD25+ Treg通过CD30依赖的机制，抑制CD8+记忆性T细胞的同种排斥反应。这些研究均表明高水平的sCD30阻断了抑制性通路，导致记忆性T淋巴细胞对同种抗原的反应，由此可见，移植前血液中sCD30水平与术后排斥反应有关。在一项多中心的3900例尸体供肾移植研究发现，除了术前抗人类白细胞抗原(HLA)和T淋巴细胞功能外，术前sCD30水平也是一种预测移植物失功的风险因子，该研究认为CD30是T淋巴细胞活化的协同刺激因子，它在记忆性T细胞的启动以及Th1/Th2细胞的平衡调节中起重要作用。

    此外，已有大量研究发现，白细胞介素(IL)-2受体α链(CD25)、转铁蛋白受体(CD71)、Fas受体(CD95)、协同刺激因子和黏附因子CD28、CD154、CD11a、CD54等均是T淋巴细胞活化和增殖的表面标记物，通过流式细胞技术均可实现分离拣出，但孵化和检测较费时(一般需时72h)，用于研究与移植临床预后关系的资料甚少。近年来发现一种可穿透细胞膜的荧光染料标记染料羧基荧光素乙酰乙酸(CFDASE)，可快速分拣出T淋巴细胞，有望在临床研究中取得突破。

1.4T 淋巴细胞释放的细胞因子

    T淋巴细胞内外细胞因子水平可间接反映T淋巴细胞活化程度，常与临床排斥反应、炎症反应和免疫抑制密切相关。活化的T淋巴细胞释放细胞因子促进免疫级联反应。目前较常用的检测指标包括T淋巴细胞活化因子包括IL-2、TNF-α、干扰素(IFN)-γ、IL-4和抑制因子包括IL-10、转化生长因子(TGF)-β等，标本可来源于血清或外周血单核细胞培养，常用的检测方法有酶联免疫吸附试验(ELISA)和酶联免疫斑点试验(ELISPOT)。由于IL-2、TNF-α分泌具有时相性，可通过逆转录聚合酶链反应检测其转录信使核糖核酸(mＲNA)水平。T淋巴细胞内外细胞因子水平可间接反映T淋巴细胞活化程度，常与临床排斥反应、炎症反应和免疫抑制密切相关。然而，这些非特异性指标往往不能直接用于预测临床预后。有学者提出，特异性指标膜抗原特异性T淋巴细胞结合细胞因子可能有望成为预测预后指标，但其应用价值有待更深入的研究。

2  以药物修饰为基础的免疫功能检测

2.1 钙神经蛋白抑制剂与T淋巴细胞活化核因子调节基因

    钙神经蛋白是T淋巴细胞活化的关键因子，也是环孢素受体和他克莫司结合蛋白12复合物作用的靶点。钙神经蛋白受抑制后，下调T淋巴细胞活化核因子(NFAT)的去磷酸化作用，继而阻断活化因子如IL-2、IFN-γ等基因的转录，达到免疫抑制作用。通过对NFAT调节的靶基因研究发现，在长期口服钙神经蛋白抑制剂(CNI)类药物并达到临床稳定剂量的患者中，NFAT靶基因的表达水平变异较大，而单个个体不同时段的表达变异度＜10%，表明个体对药物敏感度的差异，因此通过检测细胞因子或其mＲNA的转录水平来监测CNI治疗时的免疫功能更为可靠。

2.2 西罗莫司与pS6K1

    西罗莫司(雷帕霉素)为1975年首次报道一种抗生素，因其结构与他克莫司相似。它与FK506结合蛋白结合，通过抑制哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOＲ)介导的信号传导通路，导致靶蛋白合成减少。西罗莫司主要阻止细胞分裂周G1期向S期转化，影响T淋巴细胞的增殖。最常用监测西罗莫司作用下游的靶蛋白有p70核糖体蛋白S6激酶1(pS6K1)和真核生物翻译起始因子4E结合蛋白1(4E-BP1)。采用蛋白质印迹法(Western blot)对肾移植患者外周血单核细胞分析发现，mTOＲ抑制剂主要作用于pS6K1的Thr389磷酸化位点，该位点与排斥反应和某些肿瘤组织募集有关。除了蛋白质印迹法，ELISA也可以用于大规模临床试验的常规检查。

2.3 吗替麦考酚酯与次黄嘌呤单核苷酸脱氢酶

    研究发现，淋巴细胞高度依赖从头途径的鸟嘌呤核苷酸合成。吗替麦考酚酯(MMF)在体内代谢转化为活性的霉酚酸，霉酚酸抑制鸟嘌呤从头合成途径的限速酶次黄嘌呤单核苷酸脱氢酶(IMPDH)的活性，阻断鸟嘌呤核苷酸的从头合成，使鸟嘌呤核苷酸耗竭，进而阻断脱氧核糖核酸(DNA)的合成。霉酚酸具有高效、选择性、非竞争性、可逆性抑制IMPDH等特点，在自身免疫性疾病和器官移植应用越来越广泛。MMF药代动力学在个体间差异大，可能与个体间IMPDH活性有关，直接检测IMPDH的活性可能是监测MMF治疗效果的有效方法。色谱法测定可不依赖淋巴细胞计数，精度和可重复性较高，亦可作为临床常规药物治疗监测方法。

3  小结

    移植术后排斥反应及免疫抑制过度相关的并发症困扰着移植界，以往主要根据免疫抑制剂药物剂量和血药浓度监测已不能满足治疗的需要。在人体复杂多变细胞免疫网络当中，任何一个单一的指标很难准确描述总体的免疫状态，更不能直接与临床预后划等同关系。已有数个中心建立了多项指标评估移植患者免疫功能的模型，并与临床预后有一定关联。未来，结合个体基础免疫状态、同种移植排斥和耐受机制及免疫治疗药物的药代、药效动力学指标可能是免疫抑制治疗监测的方向。

参考文献:略