器官移植排斥反应风险生物标志物研究进展

大光

摘要：排斥反应是引起移植失败的最主要原因，目前临床采用的指标特异度和灵敏度均较差，不能精准地提示排斥反应的确切病因，寻找新的排斥反应监测标志物具有十分重要的临床意义。近年来在移植病理学、免疫细胞与调节性免疫细胞、非人类白细胞抗原抗体、外泌体、游离DNA、组合基因预测等方面有一些生物标志物可为器官移植排斥反应预警和治疗提供参考。


器官移植排斥反应风险生物标志物研究进展
作者：石炳毅、陈文、刘志佳     
作者单位：中国人民解放军总医院第八医学中心全军器官移植研究所
来源：《器官移植》 2020年3月 第11卷第2期


　　器官移植是治疗各种终末期器官疾病最有效的方法。排斥反应是引起移植失败的最主要原因。就肾移植而言，目前临床通常采用传统的肌酐、肾小球滤过率（GFR）、尿蛋白和供体特异性抗体（DSA）等指标监测排斥反应的发生，具有一定的使用价值。然而这些指标特异度和灵敏度均较差，不能精准地提示排斥反应的确切病因。当出现异常时，移植物常常已经出现了不可逆性损伤，治疗效果往往不佳。因此，寻找新的排斥反应监测标志物具有十分重要的临床意义。免疫学、外泌体、基因技术的发展，推动了器官移植向个性化、精准化发展。同时标准化、前瞻性、包含多种临床结局的临床数据库的建立也将器官移植带入信息化、大数据、多中心合作的时代。
　　本文总结了近年来移植排斥反应风险生物标志物研究的最新进展，为器官移植排斥反应预警和治疗提供参考。


1 移植病理学


　　移植病理学研究最早开始于1926年，研究人员发现移植肾组织内可观察到大量淋巴细胞浸润和严重肾小球损伤，并认为这些病理损伤是引起移植肾失功的重要原因。之后移植病理学一直紧随着器官移植逐步发展和规范化，目前已经建立了国际统一的各移植器官病理学诊断标准。
　　供肾移植前病理学评估能够清晰地观测到肾小球数量、硬化肾小球比例、细小动脉数量和炎症细胞浸润，准确评估供肾质量和预测移植效果，这对于扩大标准供者（ECD）至关重要。
　　Banff 2017会议进一步明确了病理在排斥反应诊断的重要性，特别是对于抗体介导的排斥反应（AMR），提出了组织损伤形态学证据、抗体作用于血管内皮的证据、DSA[抗人类白细胞抗原（HLA）抗体或非HLA抗体]的血清学证据3条诊断标准。
　　基于组织病理，分子病理检测能够更精准和前瞻性反映排斥反应的活动性损伤，预测移植物功能和预后。Sis等发现在AMR移植肾组织中不论是否有C4d表达，均能检测到内皮细胞相关转录本（ENDATs）的表达。相对于C4d，ENDATs能更好地预测移植物丢失，灵敏度高，但特异度较差。Loupy等在对早期常规诊断的基础上加入了AMR分子评分和ENDATs评分，发现这些因素能独立预测移植物丢失，有助于进行AMR的危险分级。
　　近几年，移植病理学逐步向大数据和智能化进展。Hermsen等对40例肾移植活组织检查（活检）切片的全片扫描图像进行数据分析和神经网络训练，在对后续82例肾移植活检标本诊断中，神经网络识别与传统人工视觉诊断结果存在高度的一致性。Loupy等观测和总结了多中心共7 000多例肾移植患者及其预后的影响因素，发现8个组织病理学和免疫学独立因素与移植失败相关，并合并为风险预测评分系统（iBox），随机对照试验结果显示iBox可以准确预测移植肾的3年、5年和7年的存活率，且适用于不同时间段、不同临床中心和不同免疫抑制方案的病例。


2 免疫细胞与调节性免疫细胞


　　移植排斥反应的本质是同种异体移植物作为一种“异己成分”被免疫系统识别，免疫细胞攻击、破坏和清除移植物的过程。急性排斥反应主要由细胞免疫介导，而慢性排斥反应和超急性排斥反应主要由体液免疫介导。
　　目前临床上主要采用CD4+T细胞、CD8+T细胞和CD4/CD8比值监测移植患者术后的免疫状态，评估免疫抑制剂的疗效、感染和排斥反应的发生。
　　滤泡辅助性T细胞（Tfh）通过分泌白细胞介素（IL）-21，介导了B细胞增殖和分化，我们研究证实Tfh及其亚型可以有效监测肾移植术后AMR的发生。
　　DSA是AMR诊断的金标准，然而部分病理活检显示存在移植器官AMR损伤的患者，其血清DSA检测却为阴性。
　　近期Luque等研究发现相对于DSA，记忆性B细胞（mBc）诊断AMR具有更好的灵敏度。在85例明确诊断AMR的肾移植患者，高频率供者特异性mBc在急性AMR检出率为100%，在DSA阳性和DSA阴性慢性AMR检出率分别为80%和72%。纵向队列研究结果显示移植后6个月和24个月，相对于DSA，监测供者特异性mBc更容易预测亚临床AMR的发生。
　　调节性免疫细胞包括调节性T细胞（Treg）、调节性B细胞（Breg）、M2型巨噬细胞和滤泡调节性T细胞（Tfr）等。2011年，我们把这些具有负性调节功能的免疫细胞及其相互之间的复杂联系称为“调节性免疫细胞网络”，其在有效地启动免疫应答、调控应答的强度与平衡并适时终止应答的过程中发挥精确的负性调节作用。
　　Treg是最重要的调节性免疫细胞，可通过旁分泌或者直接细胞接触方式，抑制移植排斥反应，诱导肾脏、肝脏、心脏和肺脏移植物免疫耐受。研究发现在排斥反应受者淋巴细胞亚群分类中Treg的比例显著降低，且随着临床干预和病情进展发生相应的改变。最新研究显示Treg可进一步分为不同亚型，不同亚型Treg具有不同的特异性表面标志和生物学功能。CD150 high Treg和IL-35-producing Treg具有很强的免疫调控功能，而Foxp3 low CD45RA-Treg不具有免疫抑制作用，且能分泌干扰素（IFN）-γ等炎症因子。深入研究Treg分型和作用机制，对于Treg应用于器官移植诊断和精准治疗具有十分重要的意义。
　　Breg和Tfr均与体液免疫紧密相关，研究发现这两种调节性免疫细胞能够预测器官移植后AMR的发生。
　　调节性浆细胞（Preg）是最新发现的一种调节性免疫细胞，通过淋巴细胞活化基因-3分子（LAG-3）和IL-10发挥抑制浆细胞和抗体生成的功能，因此在监测和治疗AMR中可能具有潜在的应用价值。


3 非HLA抗体


　　同种异体移植物体液免疫的靶点主要为HLA，近几年越来越多研究显示，非HLA抗体在移植排斥反应，特别是AMR中也发挥着重要作用。
　　非HLA抗体可分为血管内皮组织损伤诱导产生的自身抗体和次相容人类多态性基因的非HLA抗体两大类，包括血管紧张素Ⅱ-1型受体（AT1R）、基底膜聚糖和自身抗原等产生的抗体。
　　Pearl等对65例肾移植患者进行两年的随访监测，发现AT1R抗体与血管炎症反应、移植肾失功密切相关。也有研究显示术前预存的AT1R抗体会引起心脏移植物的急性排斥反应，导致心脏功能受损。
　　Reindl-Schwaighofer等进行了肾移植排斥反应的遗传关联研究，发现LIMS1位点的基因组碰撞与同种异体肾移植排斥反应及抗LIMS1-IgG2和IgG3的产生有关，相对于对照组，其急性排斥反应发生率升高60%。统计数据显示LIMS1不匹配发生在12%～15%的欧洲和非洲血统人群中，在东亚血统人群中却十分罕见。


4 外泌体


　　外泌体是近几年的研究热点。几乎所有的细胞均可以分泌外泌体，外泌体也保持着供者细胞的某些生物学特性。
　　Li等研究发现未成熟树突状细胞源性外泌体可诱导心脏移植物的免疫耐受。Treg源性外泌体能够延长移植肾的存活时间，降低免疫细胞对肾组织损伤。特殊的生物学结构使得外泌体可携带核酸和小分子等，特定的化学修饰和组装可显著提高外泌体作用效果和靶向性。
　　Wen等在间充质干细胞源性外泌体内组装小分子RNA，可抑制淋巴细胞增殖，增强Treg功能，提高胰岛移植的治疗效果。
　　在移植排斥反应过程中，也会产生特异性的外泌体，比如在心脏移植动物实验中，排斥组血清中可检测到肌球蛋白和波形蛋白的自身抗体，以及表达自身抗原的外泌体。
　　诊断为闭塞性细支气管炎综合征（BOS）的肺移植受者外周血中分离的外泌体表面可检测到供者HLA、肺自身抗原和细胞黏附分子等的表达。
　　某些特定细胞源性的外泌体在排斥反应过程也会发生变化。笔者团队对比了AMR和非AMR肾移植患者外周血Tfh及亚型Tfh源性外泌体，发现AMR组IL-21-producing Tfh源性外泌体比例显著升高，外泌体表面细胞毒T淋巴细胞相关抗原（CTLA）-4也发生了显著的变化，在预测排斥反应及其病因中具有潜在的应用。
　　Treg、Tfr和Preg等在外周血所占比例很小，移植排斥反应很难引起这些调节性免疫细胞源性外泌体出现显著的变化，监测外泌体表面特异性标志物可能具有更好的临床意义。


5 游离DNA


　　游离DNA（cfDNA）是指细胞外处于游离状态的DNA片段，目前已经应用于胎儿产前筛查和诊断、恶性肿瘤筛查和基因突变位点检测等，具有很好的临床应用前景。器官移植伴随着供者基因组的移植，在受者外周血可以检测到供者来源cfDNA。
　　研究发现肺移植术后，受者血浆中供者来源cfDNA含量在48 h内逐渐升高，1周后减少至正常水平。cfDNA主要来源于凋亡或者坏死的细胞，因此在排斥反应患者体内，供者来源cfDNA含量会显著升高。
　　Schütz等精确定量肝移植受者血浆中的cfDNA，发现急性排斥反应组供者来源cfDNA含量显著高于移植物功能稳定组，比常规肝功能检测更早更灵敏地判断出肝移植物的损伤。
　　Beck等采用微滴度数字聚合酶链反应（ddPCR）定量检测了肾移植、肝移植和心脏移植术后cfDNA含量，发现肾移植患者血浆供者来源cfDNA含量＜2.5%、肝移植＜6.8%、心脏移植＜3.4%可以认为移植物功能稳定，发生排斥反应风险较低。
　　Sigdel等采用基于单核苷酸多态性（SNP）的大规模多重聚合酶链反应（PCR）检测肾移植受者血浆中cfDNA含量，来预测移植排斥反应和移植肾损伤，结果显示这种检测手段的灵敏度为88.7%，特异度为72.6%，相对于其他cfDNA检测方法，特异度更高。


6 组合基因预测


　　近几年，基因检测技术逐渐进入临床应用，指导肿瘤放射治疗、化学药物治疗、靶向药物使用以及抗血小板治疗等。排斥反应相关基因可分为免疫相关基因、细胞信号转导通路相关基因、转录调控相关基因和细胞骨架蛋白相关基因等多种类型。
　　Van Loon等筛选和验证了8个基因（CXCL10、FCGR1A、FCGR1B、GBP1、GBP4、IL15、KLRC1和TIMP1），在肾功能正常阶段即可诊断AMR的发生，这些组合基因的变化与毛细血管炎症密切相关，与T细胞介导排斥反应引起损伤没有显著的相关性。
　　Zhang等进行多中心前瞻性研究，验证了17个与亚临床型急性排斥反应相关的基因，结果显示术后90 d这些基因的表达可以准确判断这期间内是否发生了亚临床型急性排斥反应，且与1年、2年后移植肾的存活率和肾功能损伤紧密相关。
　　慢性肾脏纤维化是肾移植术后常见的并发症，也是移植肾失功的重要原因。研究人员从移植后第3个月的活检组织中筛选出13个基因，这些组合基因可以预测1年后慢性肾脏纤维化的风险，准确性要高于其他临床和病理检测手段。
　　移植基因组学的体系建立是一个十分庞大的工程，目前仍处于起步阶段，需要前瞻性、多中心、大样本的基础和临床研究共同支撑。基因技术的发展将进一步推动排斥反应相关基因的筛选，指导临床医师在移植物不可逆损伤发生前，制定或者调整治疗方案，预防排斥反应等的发生。


7 结语


　　近年来，分子生物学、基因组学和人工智能等多学科的交叉融合共同推动了器官移植向“宏观”和“微观”相结合的方向发展。移植病理学智能化诊断基于组织病理的大数据分析和神经网络训练，排斥反应相关基因筛选和组合则需要大规模的基因测序和功能验证。外泌体、非HLA抗体、cfDNA等领域的进展则将排斥反应风险生物标志物检测从目前细胞层面推动到纳米、蛋白质、基因水平。当然这些检测方法也存在很多不足，比如移植物穿刺有创、部分指标诊断特异度不高、缺乏足够临床数据支撑等。可以预见，随着基因技术、免疫学和人工智能的发展，符合临床需求的生物标志物将会很快应用于排斥反应的诊断和风险预测，为器官移植个性化和精准化治疗提供数据支持。


参考文献　略


石炳毅, 陈文, 刘志佳. 器官移植排斥反应风险生物标志物研究进展[J]. 器官移植, 2020, 11(2): 194-198. doi: 10.3969/j.issn.1674-7445.2020.02.003

【链接】


肾移植受者排斥反应的风险评估
http://bbs.yizhiwang.org.cn/forum.php?mod=viewthread&tid=76309


器官移植受者免疫状态监测最新进展
http://bbs.yizhiwang.org.cn/forum.php?mod=viewthread&tid=87019