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器官移植已成为多种终末期疾病的有效治疗手段，但器官移植受者术后需长期服用免疫抑制药，导致免疫功能低下，使得细菌、病毒和真菌感染的发生率相对较高。以病原学培养、免疫学检测和聚合酶链反应为代表的传统微生物检测方法被广泛用于感染检测，但存在耗时长、需预先假定病原体等问题。宏基因组二代测序由于具有病原体检出率高、对病原谱检测全面的优点，近年来被广泛应用于器官移植领域的感染防控。本文就宏基因组二代测序技术在实体器官移植感染防控上的应用现状进行综述，以期对移植相关感染的诊断和治疗提供参考。
宏基因组二代测序在实体器官移植感染防控中的应用
作者：满霖1,李小杉1,王文静2,钱婷1,熊敏1,杨航1,陈静瑜1,吴波1,
作者单位：1.南京医科大学无锡医学中心 无锡市人民医院 南京医科大学附属无锡人民医院肺移植中心；2.南通大学附属江阴医院重症医学科
来源：《器官移植》2024年第2期
实体器官移植（SOT）受者术后需长期服用免疫抑制药，属于免疫缺陷人群，由于其处于免疫抑制状态，易感染各种致病微生物，其中不乏机会性感染病原体。以肺移植受者为例，若未使用抗病毒药物预防，术后巨细胞病毒感染发生率可达54%～92%；其余SOT受者除巨细胞病毒以外的机会性感染发生率为0.2%～15.0%。绝大多数SOT受者曾在重症监护室（ICU）接受监护和治疗，术后易感染耐药微生物，这均为SOT术后康复带来了巨大挑战。因此，早期诊断感染、确定致病微生物和应用敏感药物，在SOT受者的术后管理中极其重要。
宏基因组二代测序（mNGS）是一种二代测序技术，对病原微生物的检测周期一般为72h以内，其能通过检测样本中的病原体基因序列，完成对病原体的识别。目前，mNGS在无创产前检查、SOT后的排斥反应监测、肿瘤辅助诊断以及感染检测等临床领域被广泛应用。本文主要综述mNGS在SOT感染防控中的应用。
1. SOT过程中感染的流行病学及防控挑战
SOT术后受者普遍易发生感染。据报道，45.0%～60.2%的肾移植受者在术后第1年内发生过至少1次感染。而国内一项针对肝移植受者的研究表明，在肝移植术后早期，有71.4%的患者发生过感染。另一项在瑞士开展的包含286例肺移植受者和213例心脏移植受者的研究表明，术后第1年内感染的累积发生率分别达62%和60%，且均以细菌感染最为多见。
就易感病原体的类型而言，SOT术前绝大部分患者尚未应用免疫抑制药，同种异体反应性T细胞功能尚存，感染主要以细菌感染和真菌感染为主。在SOT术后的第1月内，局部或全身感染较术前更为多见，而SOT受者最常见的医院感染部位是下呼吸道。鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、嗜麦芽窄食单胞菌和肠杆菌科的大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌等革兰阴性菌感染占呼吸机相关下呼吸道感染的50%～80%，其高危因素可能与较长的手术时间、频繁的机械通气支持、免疫抑制药应用导致的免疫功能低下和咳嗽反射的减弱有关。
术后感染此类细菌的受者，首发表现主要是发热、咳嗽、咳痰，部分还可出现呼吸困难，甚至伴随血流感染或脓毒症。国外研究显示，约40%的血流感染发生在SOT术后1个月内；就不同移植类型而言，在SOT术后1个月内，肺移植受者血流感染发生率高达15.76%，而心脏移植受者血流感染发生率仅为2.21%。
近年来，铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌等革兰阴性菌对抗菌药物的耐药性有升高趋势，给SOT的术后管理提出了新的挑战。
术后1个月至1年内，各种潜伏感染、机会性感染逐渐增多，真菌、细菌、病毒、寄生虫感染在此阶段均可见；术后1年后，感染则逐步过渡到以社区获得性感染为主。一项包含54个国家、222所医疗机构的多中心研究表明，17.6%的社区获得性肺炎患者存在免疫力低下的危险因素，其中包括器官移植和长期应用糖皮质激素。
感染与术后各种并发症的发生发展有紧密的联系，严重影响患者的近远期生存。因此，在移植围手术期对患者的感染类型进行及时有效地识别具有重要意义。
2. 感染性疾病的诊断方法
2.1 传统病原学检测
传统病原学检测方法被常规应用于感染性疾病的诊断，包括培养法、血清学检测、聚合酶链反应（PCR）等。
目前，培养法仍是鉴定病原体和耐药分析的金标准，但培养法所需时间长，且对包含多种微生物样本的检测性能较差；其次，经验性应用抗生素后，培养的阳性率低，且此类检测方法对于条件致病菌检出率不高。
血清学检测对既往感染有重要的提示作用，但部分病原微生物不表达特异性抗原或不诱导产生特异性抗体，限制了血清学检测方法的临床应用。
PCR检测虽在灵敏度、特异度和检测耗时等方面明显优于传统培养法，但由于PCR检测是靶向测序方法，需事先假设病原体，对未知病原体的识别能力差。
以上原因限制了传统病原学检测手段在SOT领域的诊断效率，而SOT人群免疫力低下，病情进展快。因此，亟需一种检出速度快、检出率高、无需预先假设病原体的方法对SOT受者的感染进行辅助诊断。
2.2 宏基因组二代测序（mNGS）
近年来，宏基因组学在感染性疾病的诊断中发挥了巨大作用，其直接从送检样本中提取所有微生物的DNA，研究样本中包含的全部微生物的种类分布及遗传组成。进行mNGS检测首先需要对样本中的核酸进行提取，并利用BGISEQ平台构建文库并进行测序；再通过去除低质量和过短的核酸序列，生成高质量的测序数据，并在排除人源性的宿主序列后，将剩余序列与基于美国国家生物技术信息中心（NCBI）的微生物数据库进行对比，得出相应报告。因此mNGS作为一种依托二代测序平台的核酸测序技术，在一次样本检测中可以对多种微生物的核酸片段进行特异性的识别。Zhao等在一项针对真菌、细菌合并感染患者的研究表明，mNGS对细菌的检出率为89.9%，显著高于传统方法的21.7%，提示mNGS对合并感染的检出率更高。
在明确致病微生物前，临床医师通常只能经验性抗感染治疗，其最初使用的抗生素将影响患者病情的转归。既往许多研究证实，不恰当使用抗生素会增加患者死亡风险，而快速识别病原体则是及时、准确用药的前提。一项包含21608例血流感染患者的研究表明，约19%的经验性抗生素治疗与最终结果不一致，且与较高的病死率独立相关。
而mNGS能全面识别所有潜在的致病微生物，因此在病原体（尤其是机会致病菌）的检出上，显示出优于常规病原学检测方法的诊断价值。在耗时上，传统培养学鉴定往往需要几日至几周时间，但使用纳米孔或Illumina平台进行mNGS检测仅需花费5～24h，最长不超过72h，能为早期诊断和及时治疗赢取时间。利用纳米孔mNGS还能在不分离耐药菌株的基础上快速分析样本中的耐药基因，指导抗菌药物的合理使用，减少抗生素滥用带来的不利后果。临床上多数时候医师会在留取体液标本前经验性应用抗生素进行抗感染，这可能导致病原学培养结果阴性，且无法获取对应的药物敏感信息，给识别病原体带来了挑战。mNGS作为一种分子生物学方法，受前期使用的抗生素影响较小，对使用抗生素后的体液标本检出率仍达50%以上。因此，mNGS现已成为部分感染性疾病的重要辅助诊断工具。
3. mNGS在SOT感染防控中的应用
SOT受者是感染发生的高危人群。在术后早期，由于SOT手术破坏了器官原本的解剖结构，术后需建立新的移植物血供；加之局部淋巴引流损伤，感染特别容易发生，而感染也是众多术后并发症的危险因素。在术后中远期，由于SOT受者长期使用免疫抑制药，免疫力低下，相对正常人群更易发生各种机会感染。以肾移植为例，5%～10%的肾移植受者术后发生BK病毒性肾病，而其中的50%～80%最终发展为移植肾功能丧失。在一项针对肺移植受者的研究表明，首次发生巨细胞病毒感染的比例在术后第1、3、6个月分别为12.64%、44.26%、50.77%，且巨细胞病毒感染与慢性移植肺功能障碍的发生发展有关。
传统微生物检测方法对条件致病菌的鉴定存在检出率低、耗时长等问题。因此，选取合适的送检样本及送检时间，并利用mNGS检测病原微生物和耐药基因，对SOT受者术后管理意义重大。Parize等的研究表明，mNGS对免疫抑制患者的感染病原体检出率达到36%，而常规病原学检测方法的检出率仅为11%。再者，SOT受者术后往往需进行呼吸支持治疗，而呼吸机相关性肺炎是机械通气患者的常见并发症和重要死亡原因。Xi等在一项针对ICU中接受机械通气的感染性疾病患者的研究表明，未进行mNGS的患者28d病死率达29%，而进行mNGS的患者28d病死率仅为19.2%，提示是否进行mNGS可能影响患者的预后。
3.1 mNGS在肾移植感染防控中的应用
肾移植受者术后发生感染的危险因素较多，就流行病学的暴露因素而言，供者因素、受者因素、院内感染和社区获得性感染均能导致肾移植术后感染的发生。
正常泌尿道对外界致病菌具有一定的抵抗能力，而肾移植受者术后由于免疫抑制药应用、长期膀胱导尿等因素导致抗感染能力降低。据相关研究发现，肾移植受者术后尿路感染发生率为7%～80%。尿培养是诊断尿路感染的金标准，但因耗时过长且检出率较低，降低了其在肾移植术后尿路感染患者中的应用价值。Duan等的研究表明，在肾移植术后复发性尿路感染患者中，mNGS对各类病原体检测的灵敏度达到了1.000，远超尿培养的0.316，并在病毒感染和混合感染的检测上展现出巨大的潜力。
耶氏肺孢子菌肺炎（PJP）在SOT受者中的致死率高，并较多见于肾移植人群，是肾移植受者常见的肺部真菌感染类型。β-D-葡聚糖广泛存在于真菌细胞壁中，临床上β-D-葡聚糖试验对PJP有提示作用，但其诊断PJP的灵敏度和特异度均不高。有研究表明，mNGS诊断PJP感染的灵敏度为1.000，远高于血清β-D-葡聚糖试验的0.674；而在特异度方面，mNGS的特异度为0.963，也显著高于血清β-D-葡聚糖试验的0.814。虽然PCR能在数小时内诊断PJP，但PJP患者往往合并有其他肺部感染，对此类合并有未知病原体的感染，PCR往往表现不佳。
此外，国内一项针对肾移植受者体液标本的研究显示，mNGS对混合病毒感染的检出率达66%。mNGS的工作原理决定了其在检测合并感染中的良好表现，因此在肾移植受者术后肺部感染中，能发挥极大的诊断价值。
3.2 mNGS在肝移植感染防控中的应用
肝移植受者感染的危险因素包括术前、术中和术后相关因素。近年来，肝移植供者来源性感染维持在较低水平（约4%），但及时、准确识别供者相关病原体并精准用药对防治术后感染仍然重要。移植术前常规会对供者进行病原体检测，但由于窗口期的存在及传统微生物检测方法的低检出率，给致病微生物检测带来了挑战。
Huang等的一项前瞻性研究表明，mNGS对供肝的微生物检出率达64.3%，传统检测方法仅为28.6%；在供肝的共同感染方面，传统检测方法未能检出共同感染，而mNGS对此类感染的检出率为23.8%。
由于手术本身的复杂性、手术时间长、术后常规放置腹腔引流管及可能的肠道菌群失调、肠道菌群易位等因素，手术部位感染（SSI）是肝移植最常见的感染性并发症之一，发生率为12%～30%，其与肝移植受者1年内的死亡和移植物失功密切相关。虽然mNGS可通过直接检测手术部位的引流液诊断感染，并具有较高的阴性预测值，但作为一种高灵敏度的检测方法，容易受皮肤表面定植菌的干扰而出现假阳性，同培养学方法的一致性差。而对疑似SSI患者进行血液mNGS检测，能发现潜在的SSI，且具有较高的灵敏度和特异度。
此外，一项针对76例肝移植受者，包含122例临床样本的单中心研究表明，mNGS对诊断肝移植术后不明原因发热有优势，且术后2周内进行mNGS的肝移植受者病死率为2.63%，显著低于未行mNGS的受者。
3.3 mNGS在肺移植感染防控中的应用
经历半个多世纪的发展，肺移植已取得重大进展，但时至今日，感染仍是导致肺移植受者死亡最重要的原因，我国肺移植受者在围手术期因感染所致死亡占40%以上。在所有SOT受者中，肺移植受者最易受到感染。国外一项针对肺移植受者的流行病学研究发现，75%的感染发生在肺移植术后1年内，42%发生在肺移植术后的前3个月内，且以细菌性感染比例最高，约为48%。影响肺移植受者术后感染的因素大致包括供者因素、手术因素、受者因素和免疫抑制药的应用。肺不仅是最可能携带细菌的实体器官，也是供者出现细菌定植或感染的主要部位。院内感染、供者来源性感染、受者相关感染及SSI多发生于术后30d内，而社区获得性病原体感染在术后远期更为常见。
Lewandowska等首先于2017年证明了mNGS在肺移植受者病毒感染中的诊断能力。
由于预防性抗生素的应用，目前肺移植受者的供者来源性感染保持在较低水平，约为1%。在一项包含243例供肺的研究中，138例（56.8%）供肺至少分离出1种细菌，12例分离出多重耐药菌。Liu等设计的一个小样本前瞻性试验表明，约50%的供者肺经mNGS检出细菌，而培养学方法检出率仅为35.3%，术前mNGS检出的细菌种类与术后检出的细菌种类有明显差异。后续对结果的分析表明，该差异为术后患者新发感染导致，但mNGS的高检出率对潜在的供者来源性感染仍有显著的用药指导价值。
国内一项包含51例肺移植受者的单中心研究表明，mNGS对肺移植受者肺部感染的灵敏度为0.970，但特异度仅为0.310。此外，Zhang等通过对术后超早期（7d内）的受者进行支气管肺泡灌洗，并依据支气管肺泡灌洗液的mNGS及培养学结果调整抗生素方案，在降低患者住院费用的同时，对感染控制的总有效率达90%。因此，对术后早期的mNGS结果进行判读，并及时调整用药方案，能在一定程度上改善患者的预后。
作为与外界直接相连通的器官，供肺相较于其他供者器官感染率更高，且术后SSI与预后相关。据国外一项为期5年的单中心研究表明，肺移植术后SSI发生率为10%～15%。供者吸烟史和较长的手术时间、胸腔引流管放置时间，以及受者患有肥胖（体质量指数＞30kg/m2）、糖尿病等疾病，均会增加SSI的风险。而在SSI的分泌物培养方面，除传统培养学方法外，mNGS有成为补充检验手段的巨大潜力。
由于手术前后呼吸机的使用，细菌性肺炎在肺移植术后早期（1～30d）最为常见，而中、晚期则以各种病毒、真菌性肺部感染为主。既往研究表明，mNGS检测免疫低下患者和机械通气患者的肺部感染表现较好，并且对存在混合感染的患者，mNGS识别病原体的能力明显优于传统方法，因此在肺移植受者感染防控上，mNGS有着广泛的应用前景。
3.4 mNGS在其他SOT感染防控中的应用
mNGS应用于心脏、小肠及胰腺移植的研究相对较少，目前主要集中在术后肺部感染及手术部位感染（SSI）的识别与检测。
心脏移植受者由于术前心功能不全，常合并其他器官并发症；加之术中、术后各种侵入性操作，术后感染的发生率高。
小肠移植因小肠本身的高免疫原性，术后常因排斥反应导致肠黏膜损伤，故感染也是术后的主要并发症之一，以腹腔内化脓性感染和血流感染相对多见。
胰腺常和肾联合移植，以达到治愈糖尿病、防治糖尿病并发症的目的，但此类联合移植受者常并发感染，其中以PJP较为凶险。
因此，当心脏、小肠、胰腺及各类器官联合移植的受者术后出现严重感染或应用抗菌药物后疗效不佳时，均应考虑mNGS等技术，尽快明确诊断以指导治疗。
4. mNGS应用于SOT领域亟待解决的问题
虽然mNGS相较于传统病原学检测方法，在SOT感染的诊断及指导治疗上有诸多优势，但目前仍存在亟待解决的部分问题。
首先，mNGS的技术流程包含多个步骤，但目前在标本采集和预处理、核酸提取、文库构建、测序和数据分析等方面尚缺统一的质量控制标准。
其次，由于mNGS无偏倚检测的特点，从呼吸道等有菌环境采集的标本难以区分致病菌及定植菌，在检测致病微生物的同时也难以排除外源污染的干扰。样本的扩增步骤会对已存在的污染不断放大，发生过度扩增，甚至影响最终的检测结果。
再者，样本测序产生的序列超过99%都来自人类宿主，大量宿主核酸限制了病原微生物的检测，需通过其他技术手段移除此类序列。
此外，对于有较厚细胞壁的微生物或胞内寄生菌（如真菌、分枝杆菌、诺卡菌），其DNA较难释放进入组织标本，影响检测的灵敏度和特异度。对于高度怀疑有此类微生物感染的患者样本，往往需要加入化学试剂破坏细胞壁，促使核酸暴露。
而且目前对mNGS的结果尚缺统一的解读标准，需要临床工作者结合患者的临床表现、影像学特征及其他传统病原学检测结果加以综合考虑后，得出最终结论。
最后，相比传统检测方法，mNGS的费用较高，而SOT受者家庭负担通常较重，会限制其重复使用和广泛应用。
5. 小结与展望
mNGS作为一种新兴的病原体检测手段，有着巨大的发展潜力。目前虽然传统病原学检测方法仍在SOT的感染诊断及指导治疗上占据主导地位，但不可否认的是mNGS已在SOT受者的机会致病菌感染、重症肺炎辅助诊断、新发传染病识别等方面展现其独特的应用价值。随着该技术的进一步发展，未来有极大希望在SOT领域进一步普及和应用。
（参考文献 略）
本文仅供学习参考，完整准确内容请查阅原始文献：满霖,李小杉,王文静,钱婷,熊敏,杨航,陈静瑜,吴波.宏基因组二代测序在实体器官移植感染防控中的应用[J].器官移植,2024,15(2):289-296.
https://www.organtranspl.com/article/doi/10.3969/j.issn.1674-7445.2023181
【链接】
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发表于 2025-4-28 09:45:50