免疫抑制剂细胞内浓度测定的研究进展

大光

本文介绍了免疫抑制剂细胞内浓度、细胞外浓度和免疫抑制剂的药效三者之间关系的相关研究报道，评价免疫抑制剂细胞内浓度测定的潜在临床应用价值。

免疫抑制剂细胞内浓度测定的研究进展
作者：邵琨、陈冰、周佩军,
作者单位：上海交通大学医学院附属瑞金医院泌尿外科移植病区（邵琨、周佩军），药剂科（陈冰）
来源：《器官移植》 2021年第12卷第4期

　　实体器官移植作为目前治疗终末期器官衰竭的唯一方法，已在临床上广泛开展。免疫抑制剂的开发与应用，显著降低了早期排斥反应发生率，使移植物存活率已达到较高水平。然而，因免疫抑制强度不足导致的慢性排斥反应，以及免疫抑制剂过量所导致的感染、肿瘤及心血管疾病等不良反应，仍是最终导致移植物丢失的主要原因。迄今尚缺乏有效的免疫抑制剂药效的监测指标，使得免疫抑制剂的应用难以驾驭，是导致上述情况的原因之一。
　　临床指南推荐以治疗药物监测（TDM）来指导免疫抑制剂的使用。目前TDM的主要策略为，通过测定全血或血浆药物浓度，预测免疫抑制剂在外周血或血浆内的暴露水平，进而推测其药效。
　　TDM的应用确实减少了排斥反应及免疫抑制剂的不良反应，然而个体间血药浓度、药代动力学及药效学的影响因素较多（如药物代谢酶与转运体），临床上常常出现在免疫抑制剂的目标血药浓度范围内发生的排斥反应以及其它不良反应。研究发现，肾移植受者环孢素（CsA）的血药浓度与其靶蛋白钙调磷酸酶活性的相关性很低。而另一项研究也显示，目标血药浓度范围内（4～10ng/mL）的他克莫司（Tac）对钙调磷酸酶活性的抑制率仅为37%。以上证据表明现有TDM策略存在不足。
　　淋巴细胞是免疫抑制剂作用的靶细胞，由于其细胞膜上的三磷酸腺苷结合盒B亚家族成员1（ABCB1）等转运体的外排作用，测定全血或细胞外免疫抑制剂浓度难以准确反映真正进入靶细胞内的药物量及细胞内药物水平。因此，免疫抑制剂细胞内浓度测定，较细胞外（全血或血浆）测定，能更直接反映出与药效相关的那一部分药物暴露水平，对于免疫抑制剂的药效预测更具价值。
　　本文介绍了细胞内浓度、细胞外浓度和免疫抑制剂的药效三者之间关系的相关研究报道，评价免疫抑制剂细胞内浓度测定的潜在临床应用价值。

　　一、免疫抑制剂组织内浓度测定
　　采用细胞内浓度测定的方法以评估免疫抑制剂药效的策略经历了两个发展阶段。
　　早在30年前，已有研究报道基于移植组织样本的免疫抑制剂细胞内浓度（原位免疫抑制剂浓度）测定。1991年，Hanas等首先报道了在肾移植活组织检查（活检）组织中，应用3种放射免疫方法来检测CsA及其主要代谢产物的水平。研究发现，排斥反应组的活检组织样本CsA浓度显著低于无排斥反应组，而全血CsA浓度未发现差异，这一结果提示组织样本的细胞内CsA的浓度较全血浓度对于判断药效更具价值。次年，Sandborn等应用高效液相色谱法（HPLC）检测肝活检组织内CsA的浓度，并与全血CsA浓度相比较，同样发现排斥反应组的肝组织内CsA浓度显著低于无排斥反应组，同时两组的全血CsA浓度差异亦无统计学意义。1995年，Sandborn等在移植肝组织提取液中，采用酶联免疫分析法测定Tac浓度，与无排斥反应组比较，发生急性细胞性排斥反应组肝活检组织内Tac浓度更低，而血浆Tac浓度差异无统计学意义。当肝组织Tac浓度＜100ng/g时，对诊断急性细胞性排斥反应的灵敏度为78%，特异度为72%。Capron等在2007年应用新的检测技术——液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）测定了146例受者的移植肝组织内Tac浓度，同样发现原位Tac浓度与排斥反应的Banff评分呈显著负相关，而外周血Tac浓度在排斥反应组（Banff评分≥6分）与无明显排斥反应组（Banff评分＜6分）差异无统计学意义。MdDom等在4例移植肾活检样本中，建立了应用LC-MS/MS测定组织霉酚酸（MPA）浓度的方法，但由于样本量有限，未进行药效学评估。
　　上述有限的研究结果提示，相较于细胞外免疫抑制剂浓度，测定原位免疫抑制剂浓度在判断移植物排斥反应中似乎更具优势。但原位免疫抑制剂浓度检测存在两个问题，其一是由于免疫抑制剂的药效主要通过靶细胞——淋巴细胞产生，而理论上原位免疫抑制剂浓度并不等同于靶细胞内浓度；其二是原位免疫抑制剂浓度需采用有创操作获取移植组织样本，制备过程较为复杂，而通过病理诊断往往已能直接反映移植物是否存在排斥反应，因此其临床应用价值有限。

　　二、外周血单个核细胞内免疫抑制剂浓度测定
　　免疫抑制剂进入体内后，分布在靶细胞的比例很少。Zahir等应用3H双氢Tac测定Tac在体内的分布，研究发现Tac在体内主要与红细胞结合[（85.30±1.50）%]，其次是血浆蛋白[（14.30±1.50）%]和淋巴细胞[（0.46±0.10）%]，提示测定全血Tac的浓度可能无法鉴别药物在靶细胞内的浓度差异。外周血单个核细胞（PBMC）主要包括具有免疫功能的淋巴细胞与单核细胞，因其分离方法较为方便及标准化，已成为研究细胞内免疫抑制剂浓度的主要细胞群。
　　（一）PBMC内他克莫司浓度与药效的关系
　　Tac作为移植临床上最重要的免疫抑制剂，PBMC内Tac浓度测定的相关研究较多。
　　2009年，Capron等在15例健康人群及65例肾移植受者中，采用LC-MS/MS建立了测定PBMC内Tac浓度的流程，奠定了Tac细胞内浓度测定方法的基础。
　　2011年，在一项关于90例应用Tac单药方案的肝移植受者的研究中，Capron等对全血Tac谷浓度、PBMC内Tac谷浓度及肝组织内Tac浓度的相关性，及其与肝移植术后1周发生排斥反应之间的相关性做了分析。结果发现，肝移植术后1周活检证实的急性排斥反应（BPAR）组（Banff评分6～9分，37例）术后1周PBMC内Tac谷浓度为（34±17）pg/106cells，显著低于对照组（Banff评分0～5分，53例）的（91±41）pg/106cells，同时肝组织内Tac浓度也更低。而术后7d的肝组织内Tac浓度与术后5d的PBMC内Tac谷浓度具有相关性（R2=0.548，P=0.0012）。而同期的全血Tac谷浓度与PBMC内Tac谷浓度、肝组织内Tac浓度及术后1周发生排斥反应无明显相关性。
　　Klaasen等在2018年应用LC-MS/MS对29例肾移植受者服药前、后1.5h PBMC内Tac浓度，以及PBMC内Tac浓度在术后1周、6周及1年的纵向变化进行了分析。研究发现肾移植术后1年内，服药前、后全血Tac浓度与PBMC内Tac浓度具有一定的相关性。尽管各个时间点全血Tac浓度在服药后1.5h有显著升高，但PBMC内Tac浓度在服药前、后差异无统计学意义。且PBMC内Tac浓度在服药前或服药后也未发现随着移植术后时间的推移而产生显著变化。研究还比较了6例受者中发生与未发生BPAR的受者在服药前、后全血和PBMC内Tac浓度，结果显示差异无统计学意义。上述两项研究结果不一致，可能与移植器官类型、研究样本量、免疫抑制方案、采样及检测方法存在差异等有关。因此，PBMC内Tac浓度对预测移植术后排斥反应发生风险的临床价值，目前尚不明确。
　　除了应用BPAR来判断Tac药效以外，研究者也比较了其它药效指标与细胞内浓度的关系。
　　白细胞介素（IL）-2及干扰素（IFN）-γ是T细胞活化后分泌的主要细胞因子。2016年，Han等采用LC-MS/MS对213例稳定期黄种人肾移植受者的PBMC内Tac浓度进行分析，结果显示全血Tac谷浓度与PBMC内Tac谷浓度存在一定的相关性（r=0.67，P＜0.001）。研究者应用流式细胞术测定T细胞IL-2及IFN-γ的表达，结果发现PBMC内Tac谷浓度高的受者，其CD4+IL-2+、CD4+IFN-γ+、CD8+IL-2+的T细胞比例更低，而全血Tac谷浓度与上述细胞因子的表达无明显相关性。
　　2019年，In't Veld等对12例健康人群进行研究，给予口服单剂（0.05mg/kg）Tac后，测定其全血、PBMC、及T细胞内Tac在服药前和服药后1.5、48、96h的浓度，并评估了上述浓度与T细胞功能之间的相关性。结果显示，全血Tac浓度与T细胞内Tac浓度存在相关性（r=0.71，P=0.009），与PBMC内Tac浓度无相关性（r=0.35，P=0.27）。该研究对健康个体的血液进行体外实验，结果显示T细胞在植物血凝素的刺激下，IL-2分泌水平与T细胞内Tac浓度具有相关性，而与PBMC内Tac浓度无相关性。该研究未发现IFN-γ的分泌与Tac细胞内、外浓度之间存在相关性。
　　Tron等在2020年采用LC-MS/MS测定了32例肝移植受者术后10d内的全血与PBMC内Tac的完整药代动力学参数，同时测定了PBMC中钙调磷酸酶活性。结果显示，全血Tac药代动力学参数[0～12h血药浓度-时间曲线下面积（AUC 0-12）、峰浓度、谷浓度等]与PBMC内参数具有一定的相关性（R2=0.53，P＜0.001）。PBMC内达到钙调磷酸酶的半数最大抑制浓度（IC50）的Tac浓度为100pg/106cells。尽管所有受者Tac的血药浓度在目标范围内（4～10ng/mL），但细胞内浓度达到钙调磷酸酶IC50水平的比例小于50%。全血和PBMC内Tac AUC 0-12与钙调磷酸酶活性AUC 0-12无相关性，而钙调磷酸酶最大抑制率与全血和PBMC内Tac的峰浓度存在相关性（R2=0.27，P=0.007和R2=0.021，P=0.019）。
　　（二）PBMC内环孢素浓度与药效的关系
　　CsA在器官移植领域应用更早，但临床上逐渐被Tac取代，关于PBMC内CsA浓度测定方法及其与药效关系的研究有限。
　　1998年，Masri等首先报道了以密度梯度离心法获取外周血淋巴细胞（实则为PBMC），并采用单克隆抗体特异性测定PBMC内CsA浓度的方法。并在此后针对肾移植受者的一系列研究中，证实发生BPAR的受者其PBMC内CsA的谷浓度或峰浓度较未发生BPAR的受者均更低。而全血CsA谷浓度与峰浓度在BPAR组与无BPAR组中差异无统计学意义。
　　2007年至2008年，Lepage等与Ansermot等分别应用荧光偏振免疫分析（FPIA）、放射免疫分析（RIA）以及液相色谱-电喷雾电离质谱法（LC-ESI-MS）建立了PBMC内CsA浓度的测定方法。研究发现，PBMC内CsA谷浓度与全血CsA谷浓度存在较弱的相关性，但未涉及免疫抑制剂药效观察。
　　（三）PBMC内霉酚酸类药物浓度与药效的关系
　　MPA类药物作为临床上广泛应用的免疫抑制剂，临床推荐采用基于血浆MPA血药浓度-时间曲线下面积（AUC）的TDM方案以优化其应用。
　　Bénech等在2007年首先应用LC-MS/MS建立了PBMC内MPA浓度的测定方法。
　　Nguyen Thi等在2013年应用LC-MS/MS测定了肾移植受者服用吗替麦考酚酯（MMF）前血浆和PBMC内MPA浓度，研究发现服药前血浆MPA浓度与服药前PBMC内MPA浓度无相关性。随后该作者对40例服用MMF的肾移植受者术后2、4、10d的MPA药代动力学参数进行了检测，采集服药前、服药后1.5h和3.5h的血样，应用LC-MS/MS测定血浆及PBMC内MPA浓度，同时应用HPLC测定其靶蛋白次黄嘌呤单核苷酸脱氢酶（IMPDH）活性。研究发现，血浆与PBMC内MPA各对应时间点浓度之间存在相关性。IMPDH活性在服药后1.5h达到最低，在3.5h后恢复到服药前水平。IMPDH活性与血浆及PBMC内MPA浓度均呈负相关。而服药后1.5h的IMPDH抑制率与血浆MPA 0-3.5h AUC（AUC from 0 to 3.5h，AUC 0-3.5）存在相关性（P=0.027），与PBMC AUC 0-3.5无相关性（P=0.323）。
　　笔者团队近期应用LC-MS/MS对27例肾移植受者进行研究，18例受者服用MMF，9例受者服用霉酚酸钠（MPS），分析服药12h内的MPA PBMC药代动力学。结果发现，MMF组受者PBMC内的MPA达峰时间显著早于MPS组受者，该结果提示了MPS延迟吸收对细胞内MPA暴露水平存在影响。此外，MMF和MPS的PBMC内MPA浓度相对更加稳定（峰浓度/谷浓度＜6），且与血浆浓度无相关性。而PBMC AUC 0-12与血浆AUC 0-12存在相关性。
　　（四）PBMC内哺乳动物雷帕霉素靶蛋白抑制剂浓度与药效的关系
　　Masri等在2007年首次报道了42例肾移植受者术后应用微粒子酶免疫分析（MEIA）或HPLC测定PBMC内西罗莫司浓度，研究显示PBMC内西罗莫司浓度与淋巴细胞计数呈负相关，但未说明PBMC内西罗莫司浓度与全血浓度间是否存在相关性。
　　Roullet-Renoleau等在2012年应用LC-MS/MS测定心脏移植受者的PBMC内依维莫司浓度。研究发现依维莫司PBMC谷浓度与全血谷浓度存在较弱的相关性（R2=0.558，P=0.0002）。
　　2015年，Robertsen等在11例肾移植受者中，应用LC-MS/MS测定了服药前及服药后0.25、0.5、1、1.5、2、3、4、6、8、10、12h全血与PBMC内依维莫司浓度。研究发现，依维莫司全血AUC 0-12与PBMC AUC 0-12呈相关性（r=0.90，P＜0.01）。2018年，该研究者对12例肾移植受者进行间隔4周的2次采样，测定全血及PBMC内依维莫司的12h内浓度（时间点同上），应用贝叶斯算法建立了一个有限采样模型，可同时预测全血和PBMC内依维莫司的AUC。研究发现，当全血浓度＜0.5μg/L时，全血与PBMC内的依维莫司浓度呈一定线性关系。因此，仅通过测定服药后1.5h的PBMC内依维莫司浓度，就能准确预测PBMC内依维莫司的AUC 0-12，均方根误差为11.3%。对于PBMC内哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）抑制剂浓度的研究报道较少。
　　从上述研究中可以发现，依维莫司与其它免疫抑制剂的不同之处，即依维莫司的全血暴露水平与PBMC内暴露水平呈相关性。并可通过单一时间点的PBMC浓度，准确推算其PBMC内依维莫司的暴露水平。提示依维莫司可能存在与其它免疫抑制剂不同的细胞内、外分布特点，而其PBMC内浓度测定的临床价值，有待于结合药效学指标做进一步评估。

　　三、其它靶细胞群的细胞内浓度测定
　　LC-MS/MS结合改进的细胞分离法可分选出更精细的靶细胞群，进行免疫抑制剂浓度测定。Falck等在2008年应用Prepacyte试剂盒分离20例肾移植受者的T细胞，应用LC-MS/MS对T细胞内CsA的药代动力学进行研究。结果发现，在发生BPAR的7例受者中，T细胞内CsA峰浓度在确诊排斥反应前1周出现显著下降。无BPAR组T细胞内CsA AUC 0-12显著高于BPAR组，而外周血CsA AUC 0-12在两组间差异无统计学意义。
　　Robertsen等应用Prepacyte试剂盒分离10例心脏移植受者的T细胞，并比较了3例轻度BPAR与7例无BPAR受者的T细胞内及全血CsA谷浓度，可能由于样本量太小，结果显示差异无统计学意义。
　　Romano等应用流式细胞术分离出CD4+T细胞及CD19+B细胞，应用LC-MS/MS对20例稳定期肾移植受者全血、PBMC、T细胞及B细胞的Tac谷浓度进行了检测，结果发现全血Tac浓度与T细胞内Tac浓度呈一定相关性（r=0.68，P＜0.05），但与PBMC及B细胞内Tac浓度无相关性；同时T、B细胞内Tac浓度也无相关性。

　　四、小结
　　治疗窗窄及个体差异大是免疫抑制剂应用过程中的两大难点，直接检测靶细胞内免疫抑制剂的浓度或暴露水平，能避开药物吸收和代谢方面的个体差异，对药物疗效的判断在理论上优于细胞外浓度（全血或血浆浓度）测定。近年来随着检测技术的发展，LC-MS/MS逐渐应用于临床，检测靶细胞内免疫抑制剂浓度有希望成为一种精确、高效且可行的TDM方案。
　　免疫抑制剂的细胞内、外浓度的关系，在大多数研究并未显示出相关性，提示药物进入细胞内的过程是复杂的，细胞表面通道转运体（主要是ABCB1）通过主动转运方式将免疫抑制剂泵出细胞外，目前被认为是导致这一现象的主要原因。人群中ABCB1基因的多态性，也部分解释了细胞内免疫抑制剂浓度的个体差异。
　　细胞内免疫抑制剂浓度监测是否能取代细胞外免疫抑制剂浓度监测用于临床指导用药，尚需解决两个问题，其一是检测技术的标准化，包括靶细胞分离技术的标准化，细胞内浓度单位的统一等。近期，国际治疗药物监测和临床毒理学会（IATDMCT）专家委员会制定了测定细胞内钙调磷酸酶抑制剂浓度的专家共识，对细胞内钙调磷酸酶抑制剂浓度测定的采样、细胞分离、纯化、药物提取及检测等多个关键环节做了说明。这将进一步推动免疫抑制剂细胞内浓度测定的临床应用。其二则是需进一步明确细胞内免疫抑制剂浓度与药效的相关性。尤其对于MPA类药物的TDM而言，单一时间点的血浆MPA浓度与血浆内的整体暴露水平相关性不佳。此外，在不同人群、不同伴随用药下，临床研究所得的以有限采样法为基础的血浆MPA AUC估算公式不相同，从而导致血浆MPA TDM临床应用受限。而细胞内MPA浓度更加接近其作用部位，因而其与药效相关性的研究，则有可能避开MPA类药物吸收、代谢与分布的个体内及个体间差异的干扰，简化MPA临床监测，更好地指导MPA类药物的临床应用。
　　关于免疫抑制剂细胞内浓度测定的研究目前还限于单中心研究，所涉及的药效学评价指标尚未完全统一，同时缺乏长期的临床效果评价，因此尚难以肯定其临床应用潜力。但免疫抑制剂细胞内浓度测定符合精准医疗的发展趋势，值得进一步深入研究。
（参考文献　略）

本文仅供学习参考，完整准确内容请查阅原始文献：邵琨,陈冰,周佩军.免疫抑制剂细胞内浓度测定的研究进展[J].器官移植,2021,12(04):489-495.
原始地址：https://www.organtranspl.com/cn/ ... 74-7445.2021.04.018