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一、什么是供者来源游离DNA？
细胞游离DNA（cell-freedNA，cfDNA）是游离于细胞外的微量内源性及异源性DNA片段，包括游离基因组DNA和游离线粒体DNA等。cfDNA以DNA-蛋白质复合物或者游离片段的形式存在于血液、尿液、胸腔积液、腹腔积液等各种体液及支气管肺泡灌洗液中，主要来源于血细胞、组织细胞、脂肪细胞等，在特定条件下还可能来源于肿瘤、移植物或胎儿等。
供者来源游离DNA（donor-derived cell-freedNA，ddcfDNA）是指器官移植术后受者循环体液中来自于凋亡或坏死供体细胞的游离DNA，其带有供者组织的细胞信息。
二、ddcfDNA在移植肾损伤检测中有哪些应用？
随着对ddcfDNA在移植肾损伤特别是急性排斥方面的认识不断深入，ddcfDNA有望成为肾移植排斥反应无创检测的生物标记物。ddcfDNA在移植肾缺血再灌注（IRI）损伤、移植肾功能延迟恢复（DGF）、不同类型急性排斥反应（体液性排斥和细胞性排斥）和多瘤病毒相关性肾病（BKVAN）等领域取得一些研究进展。
三、肾移植术后早期ddcfDNA的浓度有什么变化规律？
IRI是肾移植手术中不可避免的问题。研究显示血浆ddcfDNA水平在肾移植术后血管开放后的3h中位浓度达到20.69%，然后浓度以“L”型曲线下降，至术后9.85d后平均达到0.46%。血浆ddcfDNA浓度在心脏死亡器官捐献（DCD）供者移植中（44.99%）显著高于亲属活体肾脏捐献（LDRT）供肾（10.24%，P＝0.004），表明IRI会增加血浆中ddcfDNA，IRI严重的受者术后ddcfDNA的起始浓度更大。
死亡后器官捐献供者生前往往存在长时间低血压、低血氧和严重感染等情况，常导致供肾的急性损伤（AKI）。供肾AKI将极大可能导致移植受者发生DGF，临床上约10%～40%的肾移植受者术后会发生DGF。术后预测DGF发生有利于临床的早期鉴别诊断与治疗，术后早期ddcfDNA升高主要由IRI引起，发生DGF和non-DGF受者术后ddcfDNA水平差异无统计学意义（P＝0.89）。有研究表明，供者来源的线粒体DNA（dmtDNA）水平可作为DGF发生的标志物，DGF受者移植肾发生排斥的风险比non-DGF受者增高1.5倍。术后早期DGF导致的血清肌酐水平升高和少尿症状与急性排斥反应相似，在临床上难以区分，但治疗方式不同，因此术后早期鉴别诊断移植肾DGF和急性排斥反应对及时有效干预有重要意义。DGF受者与急性排斥反应受者的ddcfDNA在术后早期也以相同趋势下降，当DGF受者血浆ddcfDNA浓度在术后早期下降过程中出现反跳升高（＞1%），提示可能会发生急性排斥反应。
目前对于ddcfDNA用于早期鉴别诊断DGF和AR的研究数据不多，未有定论。
四、急性排斥（AR）受者与稳定组受者血浆ddcfDNA有什么差别？
目前研究认为，血浆中ddcfDNA浓度为1%时可作为AR受者和稳定组受者的阈值。
2017年美国CareDx公司主导的多中心研究表明ddcfDNA在AR受者血浆中的浓度中位数为1.6%，高于稳定组受者的0.3%（P＜0.001），以ddcfDNA＞1%用于诊断AR时，曲线下面积（AUC）为0.74，阳性预测值（PPV）为61%，阴性预测值（NPV）为84%。
Sigdel等对300份血浆样本[38例急性排斥反应（AR）、72例临界排斥反应（BL）、82例稳定同种异体移植物（STA）、25例其他损伤（OI）]检测ddcfDNA，结果表明AR（2.3%）高于BL（0.6%）、OI（0.7%）和STA（0.4%），差异均有统计学意义（P＜0.0001），利用ddcfDNA＞1%作为阈值来诊断AR，敏感度可达到88.7%，特异性达到72.6%，AUC为0.87。
已有研究主要集中在分析ddcfDNA检测AR的最优阈值方面，显示ddcfDNA作为AR诊断生物标志物的巨大潜力，然而靠ddcfDNA单一指标的阈值来划分AR和稳定组受者的临床意义具有局限性。基于ddcfDNA检测并结合其他临床指标预测AR发生风险度的研究模式，将更科学准确。
五、不同AR类型受者血浆ddcfDNA变化有什么不同？
不同AR类型的受者中ddcfDNA浓度不同，多项研究表明抗体介导排斥反应（AMR）受者与稳定组受者在血浆ddcfDNA浓度上的差异有统计学意义，但对于T淋巴细胞介导的排斥反应（TCMR）受者与稳定组受者在血浆ddcfDNA浓度上的差异研究还未达成一致结果。
研究表明ddcfDNA并不能区分TCMR组受者（0.27%）与稳定组受者（0.38%），特别在I级TCMR受者中，AMR受者血浆中的ddcfDNA平均浓度（2.9%）高于TCMR受者（＞IA级，1.2%）。然而也有研究表明AMR（2.2%）、TCMR（2.7%）和AMR合并TCMR（2.6%）组间差异无统计学意义。因此目前研究表明利用血浆ddcfDNA检测TCMR，结果准确性低于检测AMR。
有研究报道ddcfDNA浓度结合供者特异性抗体（DSA）检测可以提高诊断AMR的阳性预测值（PPV＝81%和PPV＝44%）和阴性预测值（NPV＝83%和NPV＝96%），远高于单独DSA诊断AMR的阳性预测值（PPV＝48%）。
不同类型的排斥反应有不同的医疗处置对策和预后，如TCMR通常需要针对T淋巴细胞的药物如激素、抗胸腺球蛋白（ATG）等治疗；而AMR需要针对B淋巴细胞、浆细胞等产生抗体的细胞药物如利妥昔单抗、硼替佐米等治疗。因此对于排斥风险的分级和排斥类型的准确鉴别，多指标判断比用单一指标划分排斥风险阈值更科学准确。
血浆ddcfDNA浓度在不同类型AR受者中的研究结果提示，不同损伤部位引起的血浆ddcfDNA浓度升高也有差异，AMR主要造成的是微血管损伤，其造成血管内皮细胞凋亡后产生的cfDNA可以直接进入循环血液。然而TCMR特别是Ⅰ级排斥反应，主要损伤部位是肾小管间质，小管上皮细胞入血则需要跨过血管屏障。对于TCMR中IB级以上排斥（伴有动脉炎），已有研究结果也表明血浆ddcfDNA升高明显。
对于排斥反应类型的进一步鉴别需要利用多维样本（尿液和血液）中的ddcfDNA信息来分析不同损伤部位（小管上皮细胞或血管内皮细胞）。另外其它具有组织特异性的表观遗传学特征，如cfDNA甲基化、cfDNA核小体图谱、miRNA和LncRNA等，在将来不同排斥反应损伤部位的研究中具有巨大潜力。
六、AR治疗后ddcfDNA浓度会发生什么变化？
cfDNA的半衰期非常短，因此ddcfDNA预期可以反映受者治疗后的实时状态。
目前对AR治疗后ddcfDNA浓度的动态变化研究数据还比较少。3例AR受者治疗的研究表明ddcfDNA有潜力作为治疗效果评估的实时生物标志物；2例TCMR受者（IA级TCMR受者和早期临界TCMR受者）在接受甲泼尼龙治疗后，其中1例ddcfDNA浓度从治疗的1.3%下降到治疗周期结束时的0.42%；另1例从治疗前的3.5%到治疗第2天下降至0.49%；1例C4d阳性的AMR受者在接受激素冲击和血浆置换治疗后，ddcfDNA浓度从治疗前的2.6%，下降到治疗周期结束时的后1d的0.67%（血浆置换影响ddcfDNA水平，因此建议等待1d后采样检测）。AR治疗后血浆ddcfDNA浓度迅速下降（＜2d），表明ddcfDNA可以作为排斥反应治疗预后的指标。但ddcfDNA在AR受者治疗后的动态变化规律，还需要更多的研究数据。
七、亚临床排斥反应受者ddcfDNA有什么特点？
ddcfDNA在亚临床排斥反应（SR）方面的研究报道不多。13例程序性活检并确诊为AR受者中12例受者的血浆ddcfDNA显示阳性（＞1%），PPV为92%，表明ddcfDNA在肾移植SR预测有重要意义。最近美国14个肾移植中心开展的“DART”研究（NCT02424227），验证ddcfDNA在肾移植亚临床排斥方向上的应用。
八、BK病毒相关性肾病（BKVAN）受者ddcfDNA有什么特点？
单纯的BKV感染受者和BKVAN受者在临床治疗上是不同的，目前基于尿液或血液的BKV负荷检测，对BKVAN的预测价值有限。已有研究表明BKV感染会引起尿液中总cfDNA的升高，对少量BKVAN受者的血浆ddcfDNA研究结果显示，BKVAN受者与稳定组受者血液中的ddcfDNA浓度差异无统计学意义。目前还未有专门对BKVAN受者中ddcfDNA浓度的系统研究报道。
BKV在发病前期主要潜伏于尿路上皮细胞，激活后才进入小管上皮甚至管周毛细血管，引起宿主细胞凋亡。凋亡的cfDNA是否进入血液循环系统是血液中检测到ddcfDNA浓度的关键，将来的研究需要把BKVAN的病理类型进一步细分，对无差异的血浆ddcfDNA浓度进行分组分析。另外，BKV的初期感染主要在小管上皮细胞，对BKVAN受者中的研究样本类型可以从血液扩大到尿液样本。
九、多次肾移植受者ddcfDNA有什么特点？
多次肾移植受者血浆中ddcfDNA浓度的中位数（0.29%）高于单次肾移植受者，差异有统计学意义（0.19%，P＜0.001），多次肾移植急性排斥反应受者血浆ddcfDNA浓度（1.36%）也高于稳定组受者（0.41%，P＝0.009），但与单次肾移植排斥反应受者之间差异无统计学意义（P＝0.85），表明在多次肾移植中血浆ddcfDNA检测排斥反应也是可行的。
十、受者感染对ddcfDNA有什么影响？
感染是否影响受者血浆中ddcfDNA还未有明确结论。
5例BKV感染和6例血管球性肾炎受者的研究显示，其中3例BKV感染受者和2例血球形肾炎受者血液中ddcfDNA浓度与AR时浓度差异无统计学意义。
对21例肾移植感染受者（8例脓血症、4例尿路感染、2例呼吸道感染、5例局部感染、1例CMV感染和1例念珠菌感染）ddcfDNA浓度的研究表明21例受者血浆中ddcfDNA浓度升高且高于稳定组，与AR组间差异也有统计学意义（P＝0.025）；另外4例BKVAN的受者尿液中cfDNA浓度的研究表明BKVAN尿液中ddcfDNA浓度升高，差异有统计学意义（P＜0.0001），而与AR组间差异无统计学意义（P＝0.98）。
目前感染受者体液中ddcfDNA的变化模式还不清楚，影响ddcfDNA在临床的进一步应用。
十一、ddcfDNA检测的局限性
（1）标准化问题，包括分析前、分析中和分析后三方面因素。
分析前因素如患者的基本情况、样本的收集时间、收集过程、存储条件、处理方法等都可能对检测结果产生影响。例如在采血、储存或离心过程中，cfDNA的总量可能受到溶血的影响。
分析中因素如cfDNA的提取、分析平台和技术的差异等也会产生不同的检测结果。
分析后因素如结果的处理、判定、解读等也在不同程度上影响检测结果的准确性。
目前，由于实验平台、分析平台和技术等缺乏统一标准，且由于cfDNA的总量较低，仅以非常小的片段存在，分离具有一定困难，不同实验室给出的检测结果通常存在差异，造成检测结果互认和比较具有一定难度。
（2）影响因素问题。
dd-cfDNA水平可受到移植物和受体cfDNA的双重影响，来自受体组织细胞的更新/死亡的扰动可能导致dd-cfDNA水平的变化。
在基于cfDNA的无创产前诊断的研究中发现，体质量指数（BMI）也是影响dd-cfDNA水平的因素之一。BMI很低时，dd-cfDNA水平升高。
吸烟会使cfDNA水平几乎升高3倍。
高强度运动也可以暂时性升高cfDNA的水平，至少持续几个小时。
（3）目前dd-cfDNA是反映移植物病理状态的通用标志物，数据表明dd-cfDNA水平在急性排斥反应和移植物感染过程中都会明显升高，但仍需结合其他参数，如免疫抑制剂监测、免疫监测和微生物筛查，以提高其诊断价值。
（4）cfDNA的来源尚未完全阐明，在体内的产生及清除机制也未完全明确，这些均使其临床应用受到一定限制。
参考资料：
1.蒋廷亚, 周阳, 程东瑞. 供者来源游离DNA在移植肾损伤中的研究进展 [J] . 中华器官移植杂志,2019,40( 9 ): 566-569.dOI: 10.3760/cma.j.issn.0254-1785.2019.09.013
2.郎吉萍, 苗芸. 细胞游离DNA在器官移植中的应用[J]. 器官移植, 2018, 9(6): 460-462. DOI: 10.3969/j.issn.1674-7445.2018.06.012.
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发表于 2019-11-18 11:02:32
此时此刻我也不知道啊！