免疫抑制药治疗和预防供体特异性抗体的研究进展

大光

免疫抑制药治疗和预防供体特异性抗体的研究进展
作者：王曦晗、陈冰
作者单位：上海交通大学医学院附属瑞金医院药剂科
来源：《中国药师》 2020年第23卷第11期


　　器官移植已经成为终末期器质性病变的重要治疗手段，随着免疫抑制药的发展和广泛应用，急性排斥显著降低，移植物的生存率明显改善，但是长期生存率仍然不太理想。以肾脏移植为例：免疫抑制药的使用使移植肾的短期生存率明显得到改善，如短期5年生存率＞95%，但长期存活率仍不乐观，10年存活率仅有50%。
　　过去通常认为细胞排斥反应是移植物排斥反应的主要原因。但是，随着研究的深入，越来越多的证据表明，抗体介导的体液排斥反应（AMR）在移植排斥反应中具有重要地位，有研究发现其在导致排斥的因素中所占比例高达64%。10%～20%的移植后患者在移植后5年内可检测出供体特异性抗体（DSA）。
　　DSA包括移植前预存DSA和移植后新生DSA（dnDSA）。预存DSA与移植后的超急性排斥反应密切相关，它对移植结果的影响与DSA的类型和强度有关，而dnDSA预示着AMR的开始。
　　近年来的人类白细胞抗原（HLA）分子配型和移植前进行血浆置换的技术的应用，降低受者致敏程度。使得具有妊娠、输血、接受过器官移植病史的患者体内预存DSA对移植后排斥发生的影响程度降低。所以在移植后的治疗中免疫抑制药能否抑制体内dnDSA的产生也成为减少AMR，提高移植物生存率的关键。


1　DSA的作用机制及对预后的影响


　　在同种移植急性排斥反应中，移植受体体内可产生抗同种异性抗原的抗体，包括群体反应性抗体（PRA）和DSA，如抗同种HLA（Ⅰ类和Ⅱ类）抗体，表达于红细胞和血管内皮细胞等表面的抗ABO血型抗原的天然抗体和移植物内皮细胞损伤可暴露某些隐蔽的自身抗原也可被受者体内lgM类天然抗体识别。这些抗体可通过与同种移植物细胞表面相应抗原结合而激活补体，介导补体依赖细胞毒性效应（CDC），血管内皮细胞凋亡，血管壁完整性受到破坏，随后并发组织局部缺血性损伤。
　　完整的血管内皮细胞由于有乙酰肝素表面分子的表达而带负电荷，一旦细胞表面负电荷丧失使血管内皮皮下基质暴露在凝血因子和血小板下，从而导致血管内血栓形成。
　　补体系统的激活在抗体介导的移植物损伤中起重要作用，以人类同种异体移植物急性AMR损伤模型为例，随着C5的最终激活，C5b～C9组装形成膜攻击复合体（MAC），引起细胞凋亡和死亡。
　　此外补体系统激活的副产物是过敏反应蛋白（C3a，C5a）的形成，引起趋化和炎症细胞的激活。而且由于成纤维细胞生长因子受体的改变，主要组织相容性复合体（MHC）Ⅰ型抗体本身也能诱导潜在损伤性病变。
　　在移植AMR诊断共识中同种异体移植物损伤、组织病理学改变、C4d染色阳性和DSA作为临床上AMR的诊断标准。虽然患者体内存在DSA并不能确诊AMR，但是有一些研究已经证明了DSA的存在对预后的影响，例如在肾移植后出现肌酐水平的改变、蛋白尿、移植物功能减退等等且与AMR的发生呈高风险性。
　　一项40例患者活体供肝肝移植术后90d死亡率的研究中，全部患者中有38%术后出现了Ⅰ或Ⅱ类HLA抗体阳性，且出现DSA阳性的患者在移植术后90d生存率仅为50%，远低于DSA阴性患者（84.4%）。该研究进行随访的1134d里，1、3、5年有DSA患者生存率分别为50%、50%、50%，无DSA患者1、3、5年生存率分别为77.9%、73.3%、67.2%。
　　Fujiyama等对肾移植长期生存率的研究有相似结论，存在DSA的患者在肾移植术后3、5、7、9、11年的生存率分别为92.9%、92.9%、77.9%、60.6%、60.6%，而无DSA患者肾移植术后3、5、7、9、11年的生存率分别为99.3%、98.6%、97.8%、92.0%、89.2%。
　　是否有与C1q和C3d结合的DSA可作为预测移植患者术后生存较差的因素？法国的一项多中心的研究表明，与C1q结合的DSA患者，AMR发生率更高（58.8%），且与非C1q结合的DSA患者（发生率为37.5%）相比，C1q结合的DSA患者自AMR发生起至12个月后蛋白尿明显加重，移植物存活率更低。
　　但是也有部分研究表明体内dnDSA或移植前体内预存DSA的存在并不总是与不良预后相关。如deSousa等回顾性分析86例肾移植患者，将他们分为移植前体内存在DSA组（n=21）、无DSA组（n=43）和移植后dnDSA组（n=22），比较移植术后1年内肾小球滤过率、蛋白尿等指标，结果显示术后1个月内，3组肾小球滤过率分别为（46.6±18.5）、（41.6±19.9）和（52.6±26.1）ml/min/(1.73m2)（P=0.24），3组间术后1年内的肾小球滤过率和蛋白尿差异也无统计学意义。而且DSA程度的荧光强度（MFI）也与AMR的发生率无关。作者分析统计结果存在差异可能原因是患者未进行活检，一些临床症状不明显的AMR未被包括。此外体内预存DSA组患者使用了足剂量的3联免疫抑制治疗，这也会有效地预防致敏患者的短期排斥反应的发生。


2　T细胞在DSA生成中的作用


　　抗体由浆细胞分泌，但B细胞对抗体的产生需要T细胞的协助和参与。即要求辅助T细胞（Th）提供B细胞激活和分化的第二信号。此外，滤泡辅助性T细胞（Tfh）对记忆B细胞的存活和B细胞向浆细胞的分化具有重要意义。
　　B细胞作为抗原递呈细胞（APC）自身参与抗原递呈。如果它们识别抗原表位并与其表面免疫球蛋白受体结合，这种抗原分子可以被内化、加工，并在MHCⅡ类分子的帮助下以肽的形式呈现到Th细胞，通常是到Tfh细胞。Tfh细胞和B细胞之间的相互作用可能会通过CD40L-CD40通路和某些共刺激分子ICOS、PD-1干扰。某些细胞因子也对B细胞分泌抗体产生影响。其中，Tfh细胞分泌的白细胞介素-21（IL-21）通过B细胞上的IL-21受体（IL-21R）可以直接影响B细胞的反应。
　　过去几十年在免疫抑制治疗方面取得了进展，显著降低了T细胞介导的排斥反应的发生率，T细胞介导的排斥反应不再被认为是移植失败的重要原因。然而由于HLA分子的蛋白质特性，它们被认为是典型的T细胞依赖性抗原，这意味着B细胞在分化为产生DSA的浆细胞时，必须依赖CD4+T细胞的帮助。
　　在Chen等研究中，将缺乏CD4+T细胞的转基因AβKO小鼠作为受体，C57BL/6小鼠作为供体进行皮肤移植或心脏移植，在AβKO小鼠血清中并没有检测到DSA的存在，为了进一步验证记忆B细胞存在时所造成的影响，将A2-或BALB/c小鼠记忆B细胞注射入C57BL/6RAG2KO小鼠体内，并未发现DSA的产生，但是如果同时转移CD4+T细胞和记忆B细胞则检测出DSA，实验结果证明了CD4+T细胞对DSA的生成是必要的。
　　另外两项独立研究也表明，体内存在DSA的患者早期只有伴随着T细胞活化标志物sCD30高表达，后期才出现AMR甚至是移植物丢失。
　　虽然外周血Tfh细胞及其分泌IL-21对体内DSA生成影响的研究有限。但近年来，大量的研究证据表明Tfh细胞在抗体产生和AMR的形成中起着核心作用。而且移植后体内存在DSA的患者中往往存在循环中Tfh细胞比例增多。这些研究证据都强调了T细胞为靶点影响体液免疫反应的重要性。


3　供体特异性抗体的检测技术


　　随着移植免疫学理论研究的不断深入，DSA在移植排斥反应中的地位越来越重要。DSA的检测技术也随之发展，从以活细胞为基础的交叉配型试验，如CDC实验和流式细胞术交叉配型（FCXM）到HLA抗原蛋白为基础的固相载体吸附检测方法，如酶链免疫吸附试验（ELISA）和目前在临床上广泛应用Luminex-单抗原微珠法检测技术。
　　Luminex-单抗原微珠法检测技术伴随人类基因组计划的完成而发展起来，它运用了包括流式细胞技术、激光技术和传统化学技术等多种技术手段。通过聚苯乙烯微球与两种荧光染料混合在635nm处受到红色激光激发，使用Luminex检测系统检测波长为660nm（红色）和730nm（红外）的光，通过微球编码和测量两个通道的发光强度达到定性和定量的目的。
　　检测试剂盒方面One Lambda公司提供的LABScreen检测试剂盒和Immucor公司提供的Lifecodes Single Antigen检测试剂盒均已得到美国食品药品管理局（FDA）批准认证，两者检测的原理基本相同，只在检测HLA Ⅰ类和HLA Ⅱ类抗原种类上略有差异。
　　对患者血清进行分析有无DSA用平均荧光强度（MFI）来表示，可分为强阳性、中阳性和弱阳性3个程度。一般将MFI＞1000定义为DSA阳性。以心脏移植为例，HLA Ⅰ类抗体MFI＞5000或HLA Ⅱ类抗体MFI＞2000则可以预测AMR的发生。在对107名患者移植前血清进行回顾性分析发现，在平均随访的6.6年时间里MFI＞5000的患者与MFI＜5000相比死亡率明显增高[风险比（HR）=2.99，99.5%置信区间（CI）：（1.06，8.37）]。


4　免疫抑制药对dnDSA生成的影响


4.1　吗替麦考酚酯（MMF）
　　吗替麦考酚酯又称霉酚酸酯，是霉酚酸（MPA）的2-乙基酯类衍生物，自1995年美国FDA批准开始用于肾移植以来，已广泛用于心脏、肝脏等器官的移植。
　　MMF是前药，口服后在体内迅速水解为活性代谢产物MPA。MPA是一种高效、选择性、非竞争性、可逆性地抑制机体细胞嘌呤核苷酸合成途径中的限速酶肌酐-磷酸脱氢酶（IMP-DH）Ⅱ型的活性，从而抑制T和B淋巴细胞的增殖反应发挥免疫抑制作用。
　　但关于嘌呤合成抑制剂对dnDSA调节作用的结果尚不清楚，不同的研究对MPA抑制dnDSA生成的结论并不相同。
　　在Filler等的研究中通过对32例小儿肾移植患者平均随访9.4年得出为抑制dnDSA的生成体内MPA的浓度最低应维持在1.3mg/L并且体内暴露量AUC 0-12h应保持30mg·h/L。
　　Lederer也得到了相似的结论，154例肾移植术后患者将是否使用MMF作为分组条件，分成常规剂量组、移植后几个月之内补充MMF和不使用MMF组，最后在随访期内3组dnDSA的发生率分别为8.3%、17.2%、20.0%，说明从移植后立即开始使用MMF对体液免疫的抑制作用会更加明显。
　　但Masaki等对158例肾移植患者进行随访，结果却表明肾移植术后1年内维持低水平MPA对术后dnDSA发生率的影响差异并无统计学意义，还需要大型前瞻性研究的数据才能对MPA对dnDSA的生成的影响得出肯定的结论。


4.2　西罗莫司
　　西罗莫司，又称雷帕霉素（rapamycin），属于增殖信号抑制药（mTOR inhibition），同类药物还包括依维莫司（everolimus），它通过阻断mTOR发挥作用，而后者是细胞生长、增殖、血管生成、代谢过程中复杂的胞内信号通路的关键成分，受到阻断后导致白介素驱动的T细胞增殖受抑。体外研究的结果也表明西罗莫司可显著抑制B细胞的增殖和分化。
　　Jindra等的研究中提到HLA抗体可能传递信号从而刺激内皮细胞中多种蛋白的磷酸化，进而介导细胞功能的改变，在已经发生AMR心脏移植物活组织切片中也显示磷酸化的S6核糖体蛋白表达增加。长期服用西罗莫司则可阻断MHC Ⅰ类分子诱导的Akt在ser473位点的磷酸化和Bcl-2的表达进而阻断细胞增殖和生存信号。
　　对肾脏移植来说，一开始给予西罗莫司可改善肾脏的长期生存率。Gatault通过长期观察分别服用西罗莫司或环孢素（CsA）低风险肾移植患者的移植物活性、死亡率、生成情况等多种指标，发现西罗莫司组肾小球滤过率好于CsA组且停药后无明显有害的影响。
　　迄今为止，mTOR抑制药对dnDSA生成和AMR风险之间关系研究有限，需要更多前瞻性研究的数据进一步证明。就现有研究结果来看，使用mTOR抑制药进行免疫抑制治疗的患者，其dnDSA检出率明显低于接受其他方案治疗的患者（10.6% vs. 20.5%，P=0.025）。但是也有两篇报道指出患者改服用mTOR抑制药后dnDSA发生率显著升高的现象，这种现象可能是由免疫抑制不足导致的。
　　早期从钙调磷酸酶抑制药（CNI）治疗转向mTOR抑制药可能会增加dnDSA产生的风险，在这种情况下，如果要使用无CNI的治疗方案需要保持合适的MPA剂量并可能继续使用类固醇以降低风险并进行移植物活检和dnDSA监测。但是在移植后的第1年以后，从CNI治疗到mTOR抑制药转变并没有显示出影响dnDSA发展的风险。


4.3　他克莫司（FK506／TAC）
　　TAC在1987年首次从链霉菌中分离出来。1994年美国FDA首次批准TAC应用在肝移植的治疗中。从此，以TAC为基础的CNI与MPA、类固醇组成的3联疗法成为了常用移植术后的维持免疫抑制治疗方案。
　　它通过与FK506结合蛋白-12（FKBP-12）结合抑制了钙调磷酸酶（CaN）活性，进而阻止了活化T细胞核因子（NFAT）、p38丝裂原活化蛋白激酶MAPK）、细胞外信号调节激酶（ERK）和蛋白激酶B（PKB）去磷酸化，从而阻止其向细胞核迁移，IL-2的转录会受到抑制，降低T细胞活性，并导致免疫抑制的效果。TAC还能抑制IL-2R和信号转导及转录3（STAT3）信号的激活，导致NK细胞受体下调，进而诱导NK细胞增殖和功能缺陷，导致先天免疫功能受损。
　　随着体液免疫在急慢性排斥反应发生中的作用日益明显，在以往的研究中已经证实了TAC不能直接抑制B细胞进而抑制dnDSA的生成，CNI治疗似乎不能有效预防体液排斥反应。然而B细胞的转化和产生免疫球蛋白抗体离不开T细胞的协助，优先作用于T细胞的TAC在预防和治疗体液排斥反应的临床应用价值可能被低估了。
　　Heidt等研究通过分离纯化T、B细胞共培养，使B细胞以T细胞依赖的方式被激活检测免疫球蛋白水平，结果显示TAC几乎完全抑制了T细胞依赖性免疫球蛋白的产生，其抑制程度与MPA和雷帕霉素相当，说明通过抑制T细胞的协助，可以阻止B细胞的活化。Kraaijeveld等的体外研究也表明TAC可以显著地抑制Tfh细胞的增殖来影响B细胞的反应。
　　此外，TAC还可以抑制体内细胞因子如IL-4/IL-6/IL-10/IL-21的水平进而阻断B细胞的作用。Ballesteros-Tato和Johnston均报道IL-2是Tfh细胞分化的负调控因子，通过stat5/blimp1途径抑制体内B细胞的反应。
　　约90%以上TAC在进入体循环后与红细胞结合，但能发挥免疫抑制作用的只有少部分进入淋巴系统的游离药物。由于受小肠和肝脏首关效应及红细胞比例和血红蛋白浓度的影响，TAC的生物利用度范围为5%～90%，个体差异较大。
　　由于TAC有着狭窄的治疗窗口，目前已经有大量资源投入到TAC的药物浓度或暴露监测之中。但多为监测TAC谷浓度（C0），而C0与AUC即TAC的暴露量相关性较差，意味有相同C0的患者在一次给药期间TAC暴露量可能相差较大。
　　为了减少TAC的肾毒性，提高其有效性，尽可能使用较小的TAC的维持剂量可能是合理的手段。Girerd等对247例肾移植术后患者随访（5.0±2.0）年，其中51%的患者服用TAC，49%的患者选择CsA，结果表明减少CNI的剂量并非影响患者生存、死亡，甚至导致移植物丢失的任何因素。但TAC暴露减少也与dnDSA的发展风险增加相关，而dnDSA与不良的长期移植结果相关。在决定是否减少TAC剂量之前，必须仔细评估免疫抑制不足的益处和风险。
　　一篇合并4个研究数据的文章，通过COX多变量模型指出，无论是否使用类固醇、TAC与固定剂量MPA合并治疗的患者，在移植后前12个月内TAC的浓度不得低于4ng/ml，否则急性排斥反应的发生概率大于6.33倍。Jung等研究肾移植术后使用标准浓度或低浓度TAC结果提示，术后第1年内维持标准浓度TAC可能会减少dnDSA生成风险，且对移植肾功能改善是有益的。最近的两项研究也都将移植术后6个月内TAC标准浓度定义为5～10ng/ml或者6～9ng/ml。2019年国际治疗性药物监测和临床毒性协会发表共识，也推荐以肾移植为例患者体内TAC的暴露量AUC 0-12h不得低于150ng·h/ml。
　　随着近10年来研究的不断深入，TAC的临床管理和治疗药物监测（TDM）发生了许多变化。TAC的治疗范围已根据移植后时间、同服的免疫抑制药物和免疫风险进行了调整。很多研究团队已将监测的重点放到评估TAC临床实用性以及免疫生物标志物对移植排斥风险和临床结果的预测上。5ng/ml TAC的剂量可能是目前合适的维持剂量，但是缺乏前瞻性的多中心对照研究结果支持。
　　为了满足临床上对TAC药物监测的特异性、敏感性和精准性提出的更高的需求，单单只对TAC进行个体间药动学（PK）的监测可能不能全面掌握患者实际状况，药物毒性和PK和药效学（PD）的显著差异是临床应用的隐患，监测体内PD指标的变化可能更直观地反应出TAC免疫抑制作用的情况，其中抗体介导的急性排斥反应已经成为了移植物丢失的主要原因，而dnDSA发展的情况可直接预测AMR的发展。近早检测出dnDSA可提高移植物的存活率，dnDSA检测技术的快速发展也增加了dnDSA作为日常监测指标的可行性。
　　目前也有很多研究报道了TAC药物遗传学（PG）对TAC吸收、分布、代谢和排泄的影响。正如2019年国际治疗性药物监测和临床毒性协会（IATDMCT）发表共识中指出，为实现个体化治疗方案，TAC的治疗药物监测需结合PK、PG和PD生物标志物的知识，可进一步了解关于早期排斥风险和同种异体移植物状况。结合TAC PK-PG-PD，寻找合适的TAC体内浓度的监测方法，这可能也是未来的研究重点和方向。


4.4　环孢素（CsA）
　　CsA属于CNI，作用于T细胞活化过程中信号转导通路，起到抑制神经蛋白的作用，从而抑制T细胞生长与分化。此外CsA还可抑制辅助性T（Th）细胞，阻断淋巴细胞在抗原刺激下的增殖、分化和成熟，有利于抑制性T（Ts）细胞的增殖，可降低Th/Ts的比值。
　　目前环孢素对dnDSA生成的作用机制研究有限，但现有研究表明环孢素可抑制T细胞依赖的B细胞的增殖和抗体生成。Girerd对247例肾移植患者平均随访（5.0±2.0）年，发现CNI暴露量减少与dnDSA生成风险相关（多变量HR=9.77，P=0.002）。
　　寻找合适的CNI治疗方案，平衡肾毒性不良反应和剂量减少导致dnDSA生成风险增加的关系也是近来研究的重点。一项荷兰的多中心研究旨在比较不同免疫抑制药治疗方案对肾移植预后的影响，研究发现1年内包括TAC的治疗方案肾脏排斥反应发生率（19%）明显低于CsA组（34%）。Sahutoglu等的研究也得出相似结论，对118例患者的回顾性分析显示，CsA和TAC治疗组有着相近的长期移植物存活率，但短期CsA组C1q结合DSA的比例更高（18% vs. 0%，P=0.003），且蛋白尿和肌酐水平均高于TAC治疗组。Liu等从药物经济学角度分析27个随机对照试验中6137例患者，结果表明在预防肾移植后不良事件方面，TAC比CsA具有更高的成本效益。


参考文献　略


【链接】


肾移植和供体特异性抗体
http://bbs.yizhiwang.org.cn/forum.php?mod=viewthread&tid=74739


供体特异性抗体和抗体介导的排斥反应2019年ATC热点及新进展
http://bbs.yizhiwang.org.cn/forum.php?mod=viewthread&tid=87057


肾移植组织配型、抗体及免疫监测
http://bbs.yizhiwang.org.cn/forum.php?mod=viewthread&tid=87276


如何预防和治疗肾移植后抗体介导的排斥反应
http://bbs.yizhiwang.org.cn/forum.php?mod=viewthread&tid=87190


非HLA抗体在肾脏移植中的作用
http://bbs.yizhiwang.org.cn/forum.php?mod=viewthread&tid=86709