二甲双胍+CNI改善移植后的免疫学平衡

大光

二甲双胍与他克莫司联合治疗可通过调节Treg和Th17失衡改善系统性免疫细胞的稳态
Combination Treatment With Metformin and Tacrolimus Improves Systemic Immune Cellular Homeostasis by Modulating Treg and Th17 Imbalance
Front. Immunol., 08 January 2021
https://doi.org/10.3389/fimmu.2020.581728


　　韩国天主教大学医学院的学者研究了二甲双胍与他克莫司联合治疗对小鼠体内体外和肝移植（LT）患者体内调节性T细胞（Treg）和辅助性T细胞17型（Th17）等免疫参数的影响。评估了体外T细胞活化或同种异体刺激后的T细胞增殖和亚型。采用RNA测序和微阵列分析来评估基因表达的差异。对移植物抗宿主病（GVHD）的小鼠给予二甲双胍和他克莫司治疗，并评估其体内疗效。5名肝移植（LT）患者接受二甲双胍治疗，并检测Treg和Th17细胞的变化。联合治疗减少了体外T细胞活化后出现的辅助性T细胞1型（Th1）和Th17细胞，而与Treg相关的基因则过度表达。在体外同种异体刺激过程中，联合治疗增加了Treg细胞，减少了T细胞增殖和促炎症标志物。在GVHD小鼠中，联合治疗降低了GVHD的临床和病理严重程度。在肝移植患者中，添加二甲双胍可增加CD4+Treg和CD8+Treg细胞的外周百分比，并减少CD4+Th17细胞。该研究表明，在他克莫司治疗中加入二甲双胍可通过增加Treg细胞和减少Th17细胞来改善免疫学平衡。
　　他克莫司是一种钙调磷酸酶抑制剂（CNI），是用于预防肝移植（LT）后排斥反应的主要免疫抑制药物之一。它通过减少白细胞介素-2（IL-2）的转录来产生免疫抑制作用，从而抑制辅助性T细胞和细胞毒性T细胞的增殖。然而，他克莫司的局限性在于它也降低了CD4+CD25+FOXP3+调节性T（Treg）细胞的水平，而这些细胞对于维持免疫耐受至关重要。之前的研究也表明，在减少免疫抑制药物期间，Treg/Th17细胞比率的连续增加可能显示LT后的免疫耐受情况。
　　二甲双胍是一种著名的抗糖尿病药物，通过增加CD8+T细胞也有抗癌作用。此外，二甲双胍可以通过激活能量传感器5'-AMP激活蛋白激酶（AMPK），以及抑制哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）和信号转导与转录激活因子3（STAT3）来调控免疫反应。因此，二甲双胍通过减少Th17细胞和增加Treg细胞来调节免疫系统。
　　为了弥补他克莫司引起的免疫失衡，人们尝试用IL-2疗法、霉酚酸酯（MMF）或mTOR抑制剂的组合增加Treg细胞。考虑到二甲双胍调节的免疫途径，二甲双胍与他克莫司联合治疗可能通过平衡Treg/Th17细胞而产生有益的免疫作用。然而，二甲双胍与他克莫司的联合治疗尚未在LT受者中进行过研究。
　　这项研究进行了体外和体内分析，以检查二甲双胍与他克莫司联合治疗在T细胞活化后以及移植物抗宿主病（GVHD）小鼠模型的免疫调节作用，初步评估了联合治疗对LT患者Treg/Th17平衡的影响。


　　一、二甲双胍与他克莫司联合治疗后小鼠T细胞亚型的改变
　　检测CD3刺激后正常小鼠和GVHD小鼠脾细胞CD4+T细胞中的1型辅助T（Th1）细胞和Th17细胞的变化。流式细胞仪显示，在CD3刺激下激活的正常小鼠细胞中，与对照组和他克莫司单药组相比，二甲双胍与他克莫司的联合治疗组抑制了Th1和Th17细胞的发育。同样，在GVHD小鼠的活化T细胞中，Th1和Th17细胞的发育被二甲双胍与他克莫司的联合治疗所抑制。
　　在表达模式和KEGG（京都基因与基因组百科全书）通路的分层聚类分析中，联合治疗组与他克莫司组相似，但与二甲双胍联合治疗组相比，表达发生了一些变化。与二甲双胍单药治疗组相比，联合治疗组增强了其表达。评估基因表达差异的RNA测序分析显示，联合治疗组中与Th1和Th17细胞相关的基因特征表达下降。相反，与Treg相关的基因，包括Foxp3，在二甲双胍与他克莫司联合治疗后表达更多。
　　此外，与二甲双胍单药治疗组相比，联合治疗组中与糖酵解和Th17相关的基因的表达有所下降，而二甲双胍与他克莫司联合治疗后，与Treg相关的基因的表达比二甲双胍单药治疗更多。


　　二、二甲双胍与他克莫司联合治疗抑制同种异体反应性T细胞
　　对小鼠细胞进行体外同种异体刺激后，比较了用二甲双胍单药（500μM）、他克莫司单药（1μM，100μM）或两种药物联合治疗的各组中同种异体反应性T细胞的增殖和促炎症标志物的水平。与二甲双胍或他克莫司单药治疗相比，二甲双胍与他克莫司联合治疗能更大程度地减少小鼠同种异体反应性T细胞的增殖（P＜0.05）。此外，与单药治疗组相比，联合治疗组明显降低了干扰素（IFN）-γ和IL-17等促炎症标志物的水平（P＜0.05）。
　　在每种药物存在的情况下，同种异体刺激4天后对Treg细胞的活性进行了评估。在联合治疗的情况下，Treg细胞的数量明显比单药治疗高得多，特别是他克莫司。


　　三、二甲双胍与他克莫司联合治疗可降低GVHD的严重程度
　　在GVHD模型小鼠中，比较了每种疗法（包括联合治疗）的存活率和代表GVHD严重程度的临床评分的连续变化。诱导治疗后，与对照组相比，二甲双胍或他克莫司单药治疗的临床评分持续降低。但二甲双胍与他克莫司联合治疗的临床评分下降幅度更大，显示了这种联合治疗的协同作用。同时，与单药治疗组相比，联合治疗组的体重下降部分较少。联合治疗组也显示出比二甲双胍和他克莫司单药治疗组有更好的生存率。
　　在骨髓移植（BMT）后第38天对GVHD模型小鼠实施安乐死后，分析GVHD靶组织（皮肤、肝脏、小肠和大肠）的组织病理学。组织病理学也表明，二甲双胍与他克莫司联合治疗可以抑制炎症细胞和组织损伤。此外，与任一单药治疗相比，联合治疗后目标组织中IFN-γ和IL-17的表达明显下降。
　　二甲双胍与他克莫司联合治疗后，从GVHD小鼠脾细胞中分离出的CD4+T细胞中Treg细胞的比例明显增加，而Th1和Th17细胞则在联合治疗后减少。


　　四、在他克莫司治疗中加入二甲双胍控制人类同种异体反应性的能力
　　在体外刺激的人类细胞中，比较了用二甲双胍（500μM）、他克莫司（10mM）或二甲双胍（500μM）与他克莫司（10mM）联合治疗的患者的同种异体反应性T细胞增殖方面的差异。与单一治疗相比，联合治疗也显著降低了人类同种异体反应性T细胞的增殖。
　　在人类体外同种异体反应条件下，Treg细胞在二甲双胍单药治疗中明显增加，但在二甲双胍与他克莫司联合治疗中增加更多。
　　对同种异体刺激的人类T细胞中Th1和Th17细胞的数量以及促炎症标志物的水平的评估：二甲双胍与他克莫司联合治疗减少了Th1和Th17细胞的数量，也使IL-17和IFN-γ等促炎症标志物显著减少。


　　五、联合治疗改善肝移植受者的免疫失衡的初步数据
　　在首尔圣玛丽医院招募了新发糖尿病（DM）的LT患者。纳入标准为：18岁以上，正在接受包括环孢素或他克莫司在内的CNI治疗的患者，以及接受LT治疗3年以上且未经历排斥反应的患者。有五名患者被纳入，并在二甲双胍治疗（1000mg/d）3个月前后评估Th17和Treg水平。
　　在所有5名患者中，二甲双胍治疗后CD4+Th17细胞的数量都明显减少。但在二甲双胍与CNI联合治疗后，CD4+Treg和CD8+Treg细胞的百分比显著增加。在二甲双胍治疗期间，所有5名患者都能耐受，不需要改变CNI的剂量或添加其他糖尿病药物，血液中天冬氨酸氨基转移酶和丙氨酸氨基转移酶等肝功能标志物的水平都在正常范围内，没有明显变化。


　　讨论
　　本研究是第一个使用体外与体内分析来研究二甲双胍与他克莫司联合治疗的效果。二甲双胍与他克莫司联合治疗抑制了同种异体反应性T细胞以及Th1和Th17细胞的增殖。联合治疗还降低了促炎症标志物的水平，增加了Treg的增殖。在GVHD的小鼠模型中，通过临床评分和组织病理学评估，联合治疗降低了GVHD的严重程度。此外，在LT患者中的初步数据显示，联合治疗同时减少了Th17细胞的数量并增加了Treg细胞的数量。
　　在本研究中，二甲双胍的这种免疫学效应在他克莫司治疗的情况下得以持续。通过体外和体内研究分析，二甲双胍与他克莫司的联合治疗抑制了Th1和Th17细胞、IL-17和IFN-γ。二甲双胍是一种著名的抗糖尿病药物，最近被证明具有通过激活AMPK和抑制mTOR、STAT3和PD-1的免疫调节作用。之前的一些研究已经报道二甲双胍增加了Treg细胞的数量并减少了Th17细胞的数量。
　　本研究通过RNA测序分析，还证明联合治疗增加了Foxp3的表达，Foxp3是Treg细胞发育的主调控转录因子。联合治疗可增强Foxp3的表达，从而增加Treg细胞的比例。这些结果表明，与传统的他克莫司单药治疗相比，加入二甲双胍可改善Treg/Th17的平衡。
　　联合治疗在临床评分和组织病理学方面都比单一疗法更大程度地减轻了GVHD的严重程度，这可能是二甲双胍抑制STAT3和促进AMPK的结果。本研究的结果表明，即使在他克莫司治疗期间，加入二甲双胍也对免疫调节有好处。
　　与小鼠体内和体外研究的结果相似，早期糖尿病的LT受者在联合使用CNI和二甲双胍治疗后，显示Treg细胞增加，Th17细胞减少。之前曾有报道，基于CNI的LT治疗维持了效应T细胞的水平，但明显抑制了Treg细胞。此外，在最近的一项研究中，Treg细胞的早期减少也与接受基于CNI治疗的患者LT后的急性排斥反应有关。由于LT后维持Treg细胞对于维持耐受和免疫平衡很重要，因此，本初步研究可以预期二甲双胍治疗会改善Treg/Th17的平衡。
　　本研究也有几个局限性。
　　首先，本研究无法证明二甲双胍与他克莫司联合治疗后变化的确切潜在机制。然而，根据既往的研究可以预测由他克莫司诱导的Treg细胞的减少可以通过二甲双胍促进AMPK和抑制STAT3的作用来补偿。需要进一步的研究来证实这些二甲双胍的活性机制是否在基于他克莫司的治疗中发挥作用。
　　其次，本研究只纳入了少量的用二甲双胍治疗的早期诊断的肝移植后DM患者，而且随访期只有二甲双胍添加后的3个月。因此，对LT患者的研究结果只是初步的，还需要进一步的研究更多的患者对包括Treg/Th17细胞平衡在内的免疫细胞稳态变化方面的长期结果。
　　尽管有这些局限性，但这是第一个评估使用二甲双胍作为额外的免疫学控制的可能性的研究，不仅在体内和体外，而且对以他克莫司为基础治疗的LT患者也是如此。


　　总之，本研究的结果表明，二甲双胍可以通过增加Treg细胞和减少Th17细胞来改善他克莫司单药治疗中的免疫失衡，二甲双胍和他克莫司联合治疗可能可以使长期稳定的LT患者最大限度地减少他克莫司的用量。


本文摘自移友中庸《免疫学前沿 | 二甲双胍+CNI改善移植后的免疫学平衡》（2022-06-18 22:04），仅供学习参考。
原文地址：https://mp.weixin.qq.com/s/ffTyi8okSs2OtMGhx8tYIg
原始地址：https://www.frontiersin.org/arti ... mu.2020.581728/full


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