[讨论]302医院正式开展乙肝病毒cccDNA检测与HBV-DNA检测种类

kql

解放军302医院将在今年10月率先开展乙肝病毒cccDNA检测，cccDNA检测是最先进的乙肝病毒检测技术，通过cccDNA可以真正了解到乙肝病毒的存亡，洞察乙肝病毒的核心“发动机”情况，它是观察乙肝病情和疗效最重要的指标。检测cccDNA可以在当日上午11点前抽血采集标本，下午3点即可报告结果。

检测乙肝病毒cccDNA有以下重要意义：

一:评价慢性乙肝抗病毒治疗疗效

目前考核干扰素和核苷类药物抗病毒效果的标准通常分为主要标准和次要标准。这些标准都是建立在乙肝病毒被抑制或可能被清除的间接评价指标之上，比如，病毒DNA达到不可测水平、HBeAg消失或血清转换、HBsAg消失或血清转换等。鉴于乙肝病毒cccDNA是乙肝病毒在肝细胞内复制的初始模板，而且在肝细胞内的含量相对稳定（每个细胞约5～50 拷贝），因此公认，乙肝病毒 cccDNA是乙肝病毒难以被清除和停止抗病毒治疗后乙型肝炎复发的分子基础。只有彻底清除细胞核内的cccDNA，才是真正意义上治愈了乙型肝炎，只要细胞核内的cccDNA被彻底清除，就有理由认为乙肝病毒复制的基础不复存在了。可见，考核抗乙肝病毒药物疗效的指标，或者评价抗病毒治疗的最终疗效标准，应该是清除cccDNA，其他任何指标与之相比只能是“次要”标准。有研究表明，在血清HBsAg被清除的乙肝病毒感染者中，肝细胞内仍有cccDNA存在。清除cccDNA这一过程比较漫长，需要较高的社会、经济成本。此外，在现有条件下进行长期治疗，伴随的必然是药物不良反应的增加以及病毒耐药突变等。因此，是否把清除cccDNA作为治疗终点，还需要进行更多的研究。

二.筛选抗病毒药物
对抗病毒药物的不断研发，给慢性乙肝患者提供了更多治疗选择。但如前所述，目前的抗病毒药物均不能有效清除cccDNA，因此，开发新的、能清除cccDNA的药物是患者和医生共同的期待。鉴于cccDNA的形成是在细胞核内进行的，因此，能清除cccDNA的药物必须能干预细胞核内cccDNA形成。由于核苷类药物只能干预细胞浆内前基因组RNA逆转录形成病毒DNA负链和以负链为模板进行正链延伸的过程，自然就不能清除cccDNA。遗憾的是，cccDNA分子在细胞内形成的一些关键环节，目前还不清楚或存在争论，例如：① rcDNA分子究竟是如何通过核转位从细胞浆进入肝细胞核内的？② rcDNA在细胞核内被去掉负链的末端蛋白和正链寡RNA帽是如何实现的？③ 补齐rcDNA两条链的缺口，所需要的DNA聚合酶来自于病毒自身还是宿主？④ cccDNA从环状双链分子进一步折叠形成超螺旋分子，显然需要具有解旋、拓扑异构等生物学活性酶的参与，这些酶是来自病毒还是宿主？上述过程的阐明，将有助于指导开发新的、可能清除cccDNA的抗病毒药物。

三.评价乙肝病毒复制的模型
一种细胞或动物模型能否支持乙肝病毒复制，cccDNA显然可以作为一个较好的评价指标，因为cccDNA是病毒在细胞内进行复制的初始模板。最典型的例子是乙肝病毒转基因小鼠，尽管能检测到rcDNA 和各种病毒抗原蛋白，并且能合成大量的乙肝病毒，但在其肝细胞核内未能检测cccDNA，因此，转基因鼠不能作为乙肝病毒感染的动物模型。相反，有学者发现用乙肝病毒去感染原代培养的树肝细胞，其细胞核内存在乙肝病毒 cccDNA，因此，树可能是支持乙肝病毒复制的小动物模型。

四.评价肝组织损伤程度
乙肝病毒cccDNA分子虽存在于肝细胞核内，但从理论上推测，如果乙肝患者变性坏死的肝细胞较多，血清中是完全有可能检测到cccDNA的，而且理论上讲，肝细胞变性坏死越严重（如肝衰竭大面积肝坏死时），外周血中检测到cccDNA的机会也应该越大。

五．应用于肝移植

乙肝病毒 cccDNA检测技术在肝移植中的应用至少包括2个方面：即肝脏移植供者的筛查和受者乙肝病毒感染或再感染的早期发现。因不排除抗-HBc阳性供体肝脏中存在乙肝病毒可能，有学者主张对受者进行预防性抗病毒治疗，以防止受体感染或再感染乙肝病毒。笔者认为，完全可以对此类供体进行肝内cccDNA检测，如阴性则没有必要进行过度的预防性抗病毒治疗。同样，如受者原为乙肝病毒感染者，也可以定期对其肝组织进行乙肝病毒 cccDNA检测，判断肝细胞内有无乙肝病毒复制，以便在血液中出现大量病毒之前早期发现乙肝病毒感染或再感染，甚至有可能指导抗病毒药物的使用疗程和乙肝免疫球蛋白剂量的调整。关于cccDNA检测技术在肝移植中的应用，还有待于进一步临床研究。

－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－－以上内容来着解放军302医院刘士敬教授。

讨论一：

希望302医院随访的朋友，注意这一个信息了；

以前大家讨论是否停用乙肝免疫球蛋白（或者包括停用抗病毒药物的自我尝试，一般医生不会主张），主张很多，我感觉，重要的一个参考数据，也是相对科学的数据就是HBV-DNA，但是我们所一般看到的DNA测定值是小于1000拷贝，想想看 ，病毒数目是900和病毒数量是400和100区别是很大的。

所以，哪个医院能测定HBV-DNA数值准确到100或者50以下，那是最好不过了。302医院据说现在可以了。求证。

希望得到随访302医院的朋友的反馈。

南方，上海华山医院不行。据说，瑞金医院可以500以下，继续查询其他大的医院的HBV-DNA的检测下限？

讨论二：

这DNA的检测手段，我看到的医院检测好像是COBAS TaqMan定量PCR系统和荧光定量PCR（FQ-PCR）技术，上面又来一种，这里面分不清了？？我随访的医院，我是根据化验的价格来区别的，180元五个项目的，就是准备的定量检测。

普洱茶

以下是引用灿烂夏花在2010-9-26 10:04:05的发言：
授。

讨论一：

希望302医院随访的朋友，注意这一个信息了；

以前大家讨论是否停用乙肝免疫球蛋白（或者包括停用抗病毒药物的自我尝试，一般医生不会主张），主张很多，我感觉，重要的一个参考数据，也是相对科学的数据就是HBV-DNA，但是我们所一般看到的DNA测定值是小于1000拷贝，想想看 ，病毒数目是900和病毒数量是400和100区别是很大的。

所以，哪个医院能测定HBV-DNA数值准确到100或者50以下，那是最好不过了。302医院据说现在可以了。求证。

希望得到随访302医院的朋友的反馈。

我今年8月17日在302医院复查时乙肝病毒核酸定量HBV-DNA结果<50 IU/MI (参考值<50）

检测HBV DNA血浓度单位前些年颇不统一，如 pg/mL、 copies/mL、 log copies/mL、log IU/mL等等。在2008年亚太肝病会议上发表的新指南建议使用国际单位，即，IU/mL。1 IU/ml ≈ 5.6copies/ml 。302医院小于50IU/ml相当于小于280拷贝/ml吗?另外,各厂家的单位换算又有不同，如：罗氏Taqman48换算系数为5.82,西门子VERSANT换算系数为5.7,WHO指定为金标准的雅培Molecular为3.41302医院使用的是哪种仪器?另外,血里查不到HBVDNA可不等于乙肝清除了.如果是一个复发者,即使血中HBVDNA消失了(连续化验3次均如此),肝细胞内HBVcccDNA消失还得13.5年(计算机模拟值)。我这可不是“鸡蛋里头挑骨头”哇。

kql

以下是引用灿烂夏花在2010-9-26 10:04:05的发言：
授。

希望得到随访302医院的朋友的反馈。

我今年8月17日在302医院复查时乙肝病毒核酸定量HBV-DNA结果<50 IU/MI (参考值<50）

请问价格如何？谢谢你提供的信息。

kql

以下是引用普洱茶在2010-9-26 22:07:29的发言：

检测HBV DNA血浓度单位前些年颇不统一，如 pg/mL、 copies/mL、 log copies/mL、log IU/mL等等。在2008年亚太肝病会议上发表的新指南建议使用国际单位，即，IU/mL。1 IU/ml ≈ 5.6copies/ml 。302医院小于50IU/ml相当于小于280拷贝/ml吗?另外,各厂家的单位换算又有不同，如：罗氏Taqman48换算系数为5.82,西门子VERSANT换算系数为5.7,WHO指定为金标准的雅培Molecular为3.41302医院使用的是哪种仪器?另外,血里查不到HBVDNA可不等于乙肝清除了.如果是一个复发者,即使血中HBVDNA消失了(连续化验3次均如此),肝细胞内HBVcccDNA消失还得13.5年(计算机模拟值)。我这可不是“鸡蛋里头挑骨头”哇。

普洱茶提醒得极是，这里的50单位，不是我们平时所说的多少拷贝，特别注意了。有个换算。

另外即使HBVDNA消失，依然需要抗病毒。抗病毒是长期的。

普洱茶

老K真是老大哥！我作为退休的一名老军医对302近年来取得的进步十分感谢。我至今还珍藏着

该院一位早已走远了的老专家工工整整4页的回信。上世纪80年代初，我对他在文革期间创立的一种抗肝昏迷的治疗方法产生了质疑，他讲到该方法产生的背景，肯定了我的试验......虽一生没有谋面，一生从不相忘。

祝贺302医院的进步，腾飞！

杭州多多

普洱茶您是一名真正的老军医，仰慕！

kql

以下是引用普洱茶在2010-9-28 21:01:13的发言：

老K真是老大哥！我作为退休的一名老军医对302近年来取得的进步十分感谢。我至今还珍藏着

该院一位早已走远了的老专家工工整整4页的回信。上世纪80年代初，我对他在文革期间创立的一种抗肝昏迷的治疗方法产生了质疑，他讲到该方法产生的背景，肯定了我的试验......虽一生没有谋面，一生从不相忘。

祝贺302医院的进步，腾飞！

普洱茶大哥,我是小弟啊,哈哈,非常感谢你给我们大家的答疑解惑的.向你致敬!302医院在乙肝方面的研究应该是领先的.医学的进步对于我们来说,我们是大大的受益者.

安若泰山

关注

白雪

非常关注！！

普洱茶

HBVcccDNA的研究已有将近30年的历史，但在前20年几乎均为动物实验或体外实验，很少有来自人体的研究。人肝细胞内HBVcccDNA的存在最初是通过Southern Blot法证实的。随着PCR技术的进步，人们可以用极微量的肝组织来定量检测HBVcccDNA。但因为肝内存在各种形式的DNA，早期的定性PCR法多有假阳性!后来的定量PCR法确有精确到1000、500、300拷贝/ml之分。这种差异没有质的飞跃。
    直到2004年，有学者提出“检测患者肝组织中HBVcccDNA水平有助于确定停用抗病毒药物”，肝病学界的认识才有了一个跨越式的进步（HBV cccDNA in patients' sera as an indicator for HBV reactivation and an early signal of liver damage. World J Gastroenterol, 2004, 10: 82-85.）。
    这一认识的提高得益于技术的进步。主要是：1）用质粒安全的DNA酶来处理从肝组织中抽提出来的总HBV DNA，可以消化除HBVcccDNA之外的HBV DNA形式，包括单链DNA、松散环状DNA（rcDNA）、线状DNA等；2）设计引物位于rcDNA的缺口两端，保证rcDNA不被扩增。3）HBVcccDNA的定量测定主要使用实时荧光探针技术，通过捕获和计量有效的PCR循环中积累的荧光强度和标准曲线来计算HBVcccDNA的值。检测仪器的敏感度也越来越高。
   目前常用的检测方法是质粒安全DNA酶消化的实时荧光定量PCR法，常见的检测仪器有ABI系统、FTC2000 系统、LightCyecler系统等。
   国内文献也已有了研究报告。如天津三中心医院韩涛博士（2008.11.28《世界华人消化杂志》），上海长征医院廖晓晖教授（2009.5.5《中华医学杂志》）。通过这种检测要搞清的不是HBVDNA的血清含量，而是HBVcccDNA的含量；不只是后者在血液中的含量，而是它在每个肝细胞中含量；更进一步的是肝外易感乙肝病毒组织中HBVcccDNA的含量？只有HBV复制的模板清楚了，乙肝病毒才算真正清除了。
    这就是乙肝病毒治疗的终极目的——早在2008年第59界美国肝病研究协会年会上已经形成共识。
    302医院如果是用于临床常规检测当然值得肝友们高兴啦！
    谢谢版主的通报。