Klotho：一个潜在的移植肾保护蛋白

大光

Klotho：一个潜在的移植肾保护蛋白
作者：庄锦炀、刘东、邓庚国、王晓     
作者单位：广东医科大学
来源：《器官移植》 2020年7月 第11卷第4期


　　肾移植是治疗终末期肾病最有效的手段，但肾源匮乏仍是限制其发展的最大阻力。扩大标准供者肾脏的使用缓解了供肾短缺的压力，但也导致移植物功能延迟恢复（DGF）发生率、移植器官丢失率以及排斥风险显著提高。Klotho是高表达于肾脏的一种抗衰老基因，其编码产物Klotho蛋白对肾脏组织的炎症反应、氧化应激损伤及细胞凋亡等具有抑制作用，是一种肾脏保护蛋白，有望成为新的肾脏疾病治疗靶点。新近研究发现，Klotho对移植肾也具有潜在的保护作用。本文就Klotho的生物学特点以及Klotho对移植肾功能的保护作用进行综述。


1 Klotho的生物学特点


1.1 Klotho的结构与功能
　　Klotho是1997年Kuro-o等在盐敏感性高血压小鼠模型中发现的一种抗衰老基因，人类和小鼠Klotho基因均位于13号染色体。
　　Klotho基因的编码区含5个外显子和4个内含子，其翻译产物Klotho蛋白具有膜型和分泌型2种亚型。
　　膜型Klotho是由1012个氨基酸组成的单通道跨膜蛋白，主要表达于肾脏远端小管，其相对分子质量为130，具有KL1、KL2两个糖基水解酶功能域。膜型Klotho可作为成纤维细胞生长因子（FGF）-23的特异性共受体，与FGF-23及FGF-23受体结合成三元复合物，下调肾近端小管上Ⅱ型磷酸钠协同转运蛋白的表达，促进磷酸盐排泄。此外，膜型Klotho还参与钙盐代谢以及活性维生素D的合成。
　　分泌型Klotho由膜型Klotho经分泌酶选择性剪接产生，主要分布于血液中，少量存在于尿液和脑脊液中，其相对分子质量为62，由549个氨基酸组成，含有KL1功能域，缺乏跨膜和胞内结构。分泌型Klotho是一种体液调控因子，可作用于机体各处，发挥多种细胞保护功能，如抗衰老、抗凋亡、抗氧化应激和抑制炎症反应等。
　　越来越多的证据表明，分泌型Klotho是一种肾脏保护蛋白，各种急、慢性肾损伤动物模型均出现肾脏、血清及尿液中Klotho水平的减少，给予外源性Klotho或增加Klotho表达，可在一定程度上可缓解肾损伤，这与其多种细胞保护机制密切相关。近年来，Klotho对肾小球的保护作用也有报道。在高糖诱导的糖尿病肾病小鼠模型中，外源性给予Klotho蛋白可减轻肾小球内皮细胞损伤；Kim等发现，瞬时受体电位阳离子通道蛋白（TRPC）-6过表达可诱导小鼠肾脏足细胞损伤，引起蛋白尿，给予Klotho可抑制TRPC-6介导的足细胞Ca2+内流，减少跨越足细胞的白蛋白漏出。


1.2 Klotho在肾脏的表达和分泌


　　Klotho在人类和啮齿类动物的肾脏、大脑脉络丛、脑垂体、甲状旁腺、胰腺、卵巢、睾丸以及胎盘等组织中均有表达，以肾脏远端小管上皮细胞的表达水平最高；近端小管Klotho表达量为远端小管的1/3，刷状缘顶部具有较多的膜型Klotho分布；近年研究发现，Klotho在肾髓质、肾小球、肾小动脉、足细胞也有少量表达。
　　肾脏是循环Klotho的主要来源。双肾切除或者腹腔注射Klotho胞外结构脱落抑制剂的大鼠，均出现血清Klotho水平的显著下降，全肾细胞Klotho基因敲除的大鼠也有相同的血清学改变。
　　循环Klotho可在近端小管上皮细胞的转胞吞作用下，从基侧膜向刷状缘顶部转运，分泌到肾小管管腔，以自分泌或旁分泌的形式调节肾小管上的转运蛋白和离子通道，最终可随尿液排出。外源性Klotho在无肾大鼠血清中的半衰期明显延长，为正常大鼠的4～5倍。向正常大鼠体内注射125I同位素标记的重组Klotho蛋白，显示肾脏是摄取这些外源性Klotho的主要器官，并且在尿液中也检测到了外源性Klotho信号。说明肾脏参与了循环Klotho的清除，是调节循环Klotho水平、介导循环Klotho效应的主要器官。


2 Klotho与移植肾保护


2.1 Klotho与肾脏衰老
　　肾脏是容易受衰老影响的器官之一，随着年龄增长，肾脏自我修复能力降低，老年人慢性肾病（CKD）和终末期肾病的发生率增加。另一方面，心脏死亡器官捐献（DCD）扩大了标准供者与边缘供者的范围，但供者年龄有偏大的趋势，应用衰老肾脏进行移植，会增加肾移植术后排斥反应和CKD的发生率，降低移植肾的存活率。因此，寻找延缓肾脏衰老的靶点显得尤为重要。
　　Klotho基因是一种在肾脏中高表达的抗衰老基因，Klotho基因敲除小鼠表现出心脏肥大、动脉硬化、肺气肿、发育不良、性腺衰竭、软组织钙化、皮肤萎缩、听力丧失、认知功能受损、高磷血症等类似人类衰老的表型，并于短期内死亡，而Klotho过表达可抑制小鼠衰老，延长寿命，这可能是Klotho抑制了胰岛素/胰岛素样生长因子（IGF）-1信号通路所致。
　　有研究表明，肾脏Klotho的表达在衰老过程中有逐渐减少的趋势，Klotho低水平表达在衰老相关肾病中普遍存在，Klotho基因缺失的动物表型也与CKD患者的临床表现相似，如骨质疏松、血管钙化、性腺机能减退、不育、皮肤萎缩、认知功能障碍和体质虚弱等，而且Klotho基因缺失会导致CKD的发生率增加，加速CKD患者肾功能恶化，提示Klotho基因在衰老相关肾病的发生和发展中起着重要作用。
　　肾脏在维持机体磷酸盐稳态中起着重要作用，从肾小球滤过的约75%～85%的磷酸盐主要通过近端小管顶端刷状缘膜上的钠磷协同转运蛋白重吸收。而Klotho和FGF-23的复合物可下调钠磷协同转运蛋白的表达水平，促进磷酸盐排泄，在调节磷酸盐代谢中发挥关键作用。动物实验中，靶向敲除小鼠肾小管Klotho基因，可上调刷状缘膜上的钠磷协同转运蛋白的表达水平，引起血清磷酸盐和FGF-23水平的升高。有研究发现，顽固性高磷血症患者的血清Klotho水平明显降低，基因变异测序发现该类患者Klotho基因的第2外显子杂合缺失突变，提前引入终止密码子，体外实验发现这种突变破坏了FGF-23信号通路，这提示Klotho缺失可限制FGF-23调节磷酸盐稳态的能力，引起高磷血症。
　　高磷血症在CKD和终末期肾病患者中广泛存在，高磷酸盐水平可导致血管钙化，增加心血管疾病发生率和病死率，严重影响患者预后，因此控制血磷水平显得十分重要。最近研究报道，CKD患者血清FGF-23和Klotho的比值与磷酸盐水平呈正相关，并且有望通过改变循环FGF-23与Klotho的比值来控制磷酸盐水平。Chen等发现，Klotho过表达可通过抑制Wnt7b/β-catenin通路，逆转高磷酸盐诱导的大鼠血管平滑肌细胞钙化。这些发现为临床防治CKD和终末期肾病提供了新途径。
　　动物实验发现，骨髓干细胞移植可保留衰老小鼠肾脏中Klotho基因的表达，抑制肾纤维化，延缓肾衰老。Zhang等报道，Klotho基因过表达可增强骨髓干细胞的抗纤维化作用，进一步的机制研究发现，Klotho可通过抑制Wnt /β- catenin通路，增强干细胞的再生能力。在肾脏衰老过程中，组织细胞端粒酶活性增加，导致端粒逐渐缩短；CKD患者外周血单核细胞的端粒酶活性随着其病程进展而增加，并伴有端粒逐渐缩短；此外，移植物老化也可出现这种端粒变化，而且端粒长度与DGF、急性排斥反应和慢性移植肾功能障碍等并发症的发生率密切相关。最近Ullah等发现，端粒酶活性增加、端粒缩短是Klotho表达缺失的原因之一，Klotho可通过下调端粒酶活性和增加端粒长度来发挥抗衰老作用，从而延缓肾脏细胞衰老。因而，Klotho可作为预防肾脏衰老的潜在治疗靶点。


2.2 Klotho与肾脏缺血-再灌注损伤
　　缺血-再灌注损伤（IRI）是肾移植中无法避免的病理生理过程，IRI过程中，缺血器官或组织氧供需、能量代谢失衡，导致严重缺氧和微血管功能障碍，随后的再灌注则进一步加速先天性和适应性免疫反应的激活以及细胞死亡程序。IRI是缺血肾脏重新恢复血液灌注后，出现的一种加重肾组织功能障碍和结构破坏的病理状态，是引起肾移植术后急、慢性肾损伤的重要原因，极大影响移植肾的存活率及受者的预后。因此，减轻IRI是肾移植全程管理的关键所在。
　　多项研究证实，IRI可降低肾脏Klotho表达，而且Klotho在IRI的病理生理过程中起保护作用，给予Klotho蛋白或增加Klotho表达能改善IRI相关肾损伤。Hu等发现，IRI小鼠肾脏和血液中的Klotho蛋白水平在早期明显下降，并且随着肾损伤的减轻而回升，提示Klotho缺乏可能是IRI的早期生物标志物。此外，Klotho基因过表达能增强小鼠肾脏对IRI的抵抗能力，降低肾损伤病理评分，促进小鼠肾功能恢复。Sugiura等报道，IRI小鼠术后1d的血清肌酐和血尿素氮水平显著高于假手术组，并伴有肾Klotho蛋白表达减少，在进一步研究中，通过腺病毒将Klotho基因转染至肾细胞，发现Klotho基因过表达可明显降低IRI后血清肌酐和血尿素氮水平，并减轻肾细胞的凋亡。Castellano等建立猪肾IRI模型发现，缺血前Klotho蛋白主要表达于肾小管，再灌注24h后，肾小管上Klotho蛋白表达明显减少，使用药物提高Klotho蛋白表达可改善肾IRI。Qian等建立肾IRI小鼠模型发现，肾IRI后24h血清肌酐和血尿素氮水平明显升高，血清Klotho蛋白水平在再灌注后立即升高，5h明显下降，24h达到最低水平，而用Klotho蛋白处理可显著减少IRI引起的血清肌酐和血尿素氮水平升高。
　　氧化应激和细胞凋亡是IRI发生发展的重要病理生理机制。IRI时，肾组织活性氧产生增多，抗氧化酶被大量消耗，过多的活性氧可直接损伤组织细胞，诱导细胞凋亡，进而加重肾损伤。细胞实验发现，过氧化氢可下调小鼠肾小管上皮细胞的Klotho蛋白表达，加重细胞氧化应激损伤和细胞凋亡，而Klotho基因过表达可逆转肾小管上皮细胞中抗氧化酶的丢失，抑制过氧化氢诱导的丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路活化，减少含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3（caspase-3）表达，提高Bcl-2/Bax比值，进而减轻细胞氧化损伤和细胞凋亡。Qian等报道，腹腔注射重组Klotho蛋白可下调IRI小鼠肾脏中白细胞介素（L）-1β、受体相互作用蛋白激酶（RIPK）1和RIPK3的表达，减少凋亡细胞数量，改善肾IRI，在体外采用Klotho蛋白处理人肾小管上皮细胞和小鼠肾小管上皮细胞的缺氧-复氧模型，也下调了炎症细胞因子和程序性细胞死亡标志物的表达，并且抑制了叉头转录因子（FoxO）1和FoxO3a磷酸化，减少乳酸脱氢酶释放，缓解细胞损伤。
　　炎症反应也是IRI的病理机制之一。核因子（NF）-κB是存在于真核细胞中的一种快反应转录因子，在组织缺血相关炎症的发生发展中起着重要的调节作用，静息状态下，其与抑制性分子IκB结合，以无活性状态滞留于细胞质中，其最常见形式为P50/65异源二聚体。Panah等报道，移植肾缺血-再灌注期间可产生大量的炎症因子和氧自由基，这些物质促进IκB分解，激活NF-κB信号通路，引起其亚单位p50/p65入核，增强肾组织炎症反应和氧化应激，加重肾损伤，而Klotho可通过稳定p50/p65异源二聚体，抑制NF-κB通路，减轻肾IRI。肾IRI可激活补体系统，活化的补体可经过一系列酶促反应产生攻膜复合物，直接破坏肾小管上皮细胞结构，并可诱发炎症反应，引起细胞凋亡、坏死。Liu等研究表明，Klotho可增强猪内皮细胞对补体依赖细胞毒反应的抵抗能力，上调抗炎介质血红素加氧酶（HO）-1的表达。Castellano等报道，使用补体抑制剂可增强肾脏Klotho蛋白表达，并通过抑制NF-κB通路减轻IRI。
　　自噬是普遍存在于真核细胞中的一种胞内降解系统，具有维持细胞内环境稳定的作用，自噬与IRI联系紧密，可抑制肾小管上皮细胞凋亡，减轻IRI。体内外实验表明，Klotho可通过上调自噬通量，减轻氧化应激诱导的肾细胞损伤，缓解IRI。
　　公民逝世后器官捐献是我国现阶段移植器官的主要来源，但供肾短缺仍是影响肾移植发展的难题，仍有大量等待肾移植的患者。虽然扩大标准供者和边缘供者在一定程度上缓解了供肾短缺的压力，但这类供者普遍存在高龄、高血压、糖尿病等不利因素，IRI后会引起更严重的肾损伤，增加相应受者发生DGF和CKD的风险。广东省第二人民医院的前期研究建立了大鼠脑死亡模型，数据支持Klotho对脑死亡相关肾损伤具有保护作用，也提示Klotho与肾移植术后肾功能保护相关。


2.3 Klotho对同种异体肾移植术后肾功能的预测价值
　　临床上急性肾损伤患者可出现肾脏Klotho蛋白表达下调，其下调程度在短期内随着肾损伤的加重而愈发显著，Klotho蛋白水平低增加了这类患者肾脏替代治疗的需求率，说明Klotho蛋白水平可能对急性肾损伤的短期预后具有评估价值。
　　在同种异体肾移植中也存在Klotho蛋白水平的变化，这种变化与移植肾功能有着潜在的联系。Bleskestad等发现，肾移植受者的血清Klotho蛋白水平显著低于健康志愿者，而且在肾移植术后短期和长期的随访中，肾移植受者血清Klotho蛋白水平均低于与其肾小球滤过率相匹配的CKD患者，这种变化可能与肾移植受者急性肾损伤和免疫抑制剂导致的肾毒性有关。
　　Klotho蛋白对肾损伤具有预测价值已早有研究报道。研究发现，急性肾损伤小鼠肾脏和血清中Klotho蛋白水平均下降，并早于中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白的降低，提示Klotho蛋白水平可能是急性肾损伤的早期生物标志物之一。近年研究表明，Klotho对移植肾损伤具有潜在的预测价值。在一项回顾性研究中发现，同种异体肾移植供者的血清Klotho蛋白水平与其年龄呈负相关，供肾Klotho信使核糖核酸（mRNA）检测和免疫组织化学分析也显示出相同的趋势，受试者工作特征（ROC）曲线分析发现，高龄供者肾移植术前的血清Klotho蛋白水平与相应受者术后1个月的估算肾小球滤过率呈显著负相关，提示高龄供者血清Klotho蛋白水平对肾移植术后受者短期肾功能的恢复情况具有预测价值。DGF是肾移植术后的严重并发症，极大影响移植肾的长期存活率。Castellano等对8例DGF患者的肾穿刺活组织检查结果进行回顾性分析，发现DGF患者移植肾Klotho蛋白表达较肾移植术前显著减少，并且DGF患者血清Klotho蛋白水平在肾移植术后2年显著降低，提示Klotho缺乏可能与继发于DGF的慢性移植肾功能障碍有关。有研究表明，急性肾损伤可引起肾脏近端小管上皮细胞刷状缘膜受损，伴有细胞凋亡和坏死，提示大量Klotho蛋白可被裂解并释放到肾小管管腔中，导致短期内尿液Klotho蛋白水平急剧升高。Kimura等报道，受者在肾移植术后2d和5d，其尿液Klotho蛋白水平明显高于基线值，提示尿液Klotho蛋白水平可能是一项评价肾移植中肾小管早期损伤的新指标。


2.4 Klotho与免疫抑制剂肾毒性
　　环孢素（CsA）是肾移植中一线免疫抑制剂，其应用显著降低了排斥反应的发生率，改善了器官移植受者的近期生存率，但CsA的肾毒性可引起移植肾功能下降。肾小管间质炎症反应和纤维化是慢性CsA肾毒性的病理学特征。
　　动物实验中，持续给予大鼠CsA治疗会引起肾组织巨噬细胞浸润、细胞炎症因子表达增多，并伴有肾功能下降和Klotho蛋白水平下调，而外源性给予Klotho蛋白可改善上述反应，显著降低血清肌酐和血尿素氮水平，说明Klotho不仅参与了CsA肾损伤的病理过程，还可抑制CsA肾毒性。进一步机制研究发现，外源性Klotho可能通过上调PDZ和LIM域蛋白2（PDLIM2）表达、抑制NF-κB/p65通路，改善CsA引起的肾脏炎症反应。Liu等发现，Klotho治疗通过抑制肾小管上皮-细胞间质转化（EMT）过程减轻CsA诱导的大鼠肾纤维化。
　　新近研究报道，Klotho缺乏也可加重他克莫司相关肾损伤，而Klotho治疗可激活溶酶体功能，增强自噬清除，还可通过负调控PI3K/Akt通路，增强FoxO3介导的超氧化物歧化酶的表达，抑制氧化应激，减轻肾损伤。这些发现为临床应用Klotho减轻免疫抑制剂肾毒性提供了理论依据。


3 小结与展望


　　Klotho作为一种肾保护蛋白，对肾组织衰老、炎症反应、氧化应激及细胞凋亡等具有抑制作用。新近研究发现Klotho在肾移植领域也具有潜在治疗与预后评估价值，这些研究结果提示Klotho有望成为移植肾功能保护潜在的治疗靶点。但目前关于Klotho在肾移植方面的研究较少，减缓肾IRI方面的疗效及机制还不明确，Klotho在肾移植中的病理生理机制、肾保护作用有待进一步实验阐明。


参考文献　略