本研究对供体来源细胞游离DNA(dd-cfDNA)的释放机制、检测方法及在肾移植中的研究进展进行综述。
供体来源的细胞游离DNA在肾移植中应用的研究进展
作者：何昕阳1,2、王耀1、王海舰1、李政1、沈彬1
作者单位：1.山东第一医科大学第一附属医院泌尿外科；2.山东第一医科大学第一临床学院
来源：《大医生》2025年第9期
与肾透析相比，肾移植可有效延长肾衰竭患者的生存期，提高患者的生活质量，是终末期肾病的首选治疗方法，但术后并发症会严重影响移植物的存活和患者的长期预后。同种异体器官移植成功的主要障碍是移植后的免疫排斥反应，大剂量免疫抑制剂具有肾毒性，会增加心血管疾病、传染病和恶性疾病的发生风险。传统的诊断方法为肾穿刺活检，虽然是诊断的金标准，但具有侵入性，可能会导致出血和感染，且不能进行动态监测。目前，用于肾受体监测的微创和非侵入性诊断方法包括血肌酐、供体特异性抗体(DSA)检验和超声检查等，但均具有局限性。血肌酐虽然是最常用的生物标志物，但其主要用于监测肾小球功能，而不是肾损伤程度，并且其可测量的异常结果通常发生在移植物损伤后的24～48h，敏感度相对较低。循环游离DNA(cfDNA)指存在于血液循环中的游离DNA片段，在健康和疾病状态下均可被检测，其水平可能受多种因素的影响；供体来源的细胞游离 DNA(dd-cfDNA)是指在器官移植后，受者血液循环中来源于供体的游离DNA片段，其主要来源于细胞的凋亡或坏死，具有较高的特异度和敏感度。基于此，本研究对dd-cfDNA的释放机制、检测方法及在肾移植中的研究进展进行综述，为临床提供参考。
1 cfDNA的来源及释放机制
1.1 cfDNA的来源
cfDNA存在于细胞外的DNA片段中，主要有游离DNA、与蛋白质结合的DNA和包裹或连接细胞外囊泡中的DNA。脑脊液、胸腔积液、唾液、淋巴、母乳、胆汁、羊水和脊髓等多种体液中均可以分离出cfDNA，而最主要的来源是血液。不同疾病状态的cfDNA类型也不同，主要包括游离线粒体DNA、循环肿瘤DNA、游离胎儿DNA和dd-cfDNA。
正常生理状态下，造血细胞的更新或淋巴细胞的凋亡等生理活动会释放少量的DNA片段，但健康机体cfDNA水平相对较低(0～100ng/mL)。而在炎症、恶性肿瘤、自身免疫性疾病及器官移植等病理状态下，cfDNA的水平会相应增加。此外，中性粒细胞网补死亡(NETosis) 是中性粒细胞的一种防御机制，当中性粒细胞受病原体或其他炎症因子激活时，其染色质发生解聚，从细胞膜释放到细胞外，释放的物质构成细胞外补网以杀死和清除病原体。
1.2 cfDNA的释放机制
cfDNA的释放涉及多种复杂的细胞生物学过程和分子机制。
细胞凋亡是cfDNA释放进入循环的主要途径。细胞凋亡是一种维持稳态平衡的程序性细胞死亡形式，在凋亡过程中，细胞内的半胱天冬酶依赖性蛋白水解级联反应被激活，导致细胞收缩、染色质浓缩和碎裂，染色体DNA在核小体间被切割形成180～200bp的寡聚核小体片段包装到凋亡小体中，保护细胞免受循环核酸酶的消化，然后通过吞噬作用清除凋亡小体，并以可溶性碎片的形式释放至细胞外环境，进入血液循环成为cfDNA。
与细胞凋亡不同，细胞坏死是一种细胞非程序性死亡方式，坏死细胞表现为细胞器功能障碍和质膜畸变，导致细胞内容物包括DNA被非系统性释放和消化，其释放的DNA片段长度不一，主要以较大片段(>1000bp)的形式出现，该DNA片段是构成cfDNA的重要部分。
有研究显示，部分细胞可以主动将DNA分泌到细胞外，如肿瘤细胞可能通过外泌体等囊泡结构将DNA运输到细胞外，这些外泌体可以保护DNA免受核酸酶的降解，还可以在体液中稳定存在，进而作为cfDNA被检测。
2 dd-cfDNA的检测方法
随着分子生物学技术的发展，越来越多的方法被应用于dd-cfDNA的检测中，主要包括聚合酶链反应(PCR)法和二代测序(NGS)。
2.1 PCR检测
PCR是dd-cfDNA检测中常用的一种分子生物学技术，其基本原理是通过一系列温度循环，包括高温变性、低温退火和适温延伸，在体外实现目标DNA片段的指数级扩增。这一过程依赖于耐高温DNA聚合酶(如Taq酶)及特异性引物和荧光探针，使目标DNA在多轮循环后得到显著扩增，从而被检测仪器识别并定量分析。PCR技术的高灵敏度和高特异度，成为dd-cfDNA检测中的重要工具，能够精准地识别并扩增目标DNA片段，即使在极低的水平下也能被有效检测，为dd-cfDNA的准确测量提供有力的技术支持。
在dd-cfDNA检测中，实时荧光定量PCR(qPCR)被广泛应用。qPCR通过在扩增过程中实时监测荧光信号变化，实现对DNA的定量分析。荧光探针(如SYBR Green或TaqMan探针)能够特异性结合目标DNA片段，随着PCR循环的进行，荧光信号的累积与扩增产物的数量呈正相关，从而实现精准检测。qPCR的优势在于高灵敏度、特异度和快速检测，适用于肿瘤标志物监测、器官移植排斥反应评估等临床应用。然而，由于qPCR依赖于标准曲线进行相对定量，其定量精度受标准样本制备和实验条件的影响，限制其在应用中的准确性。
数字PCR(dPCR)是一种更精确的DNA定量技术，近年来在dd-cfDNA检测中受到越来越多的关注。dPCR通过将反应体系分割为大量微小的独立反应单元，使每个单元中最多仅包含一个目标DNA分子。随后，在上述单元中分别进行PCR扩增，并通过荧光信号检测阳性单元的数量。由于每个单元的反应是独立的，dPCR无需依赖标准曲线，即可实现绝对定量，从而提高检测的准确性和重复性。dPCR在低丰度突变检测、癌症早期筛查和器官移植排斥反应监测中表现出较好的效果，能够精准检测极低水平的变异DNA，提高检测的灵敏度。此外，dPCR能够减少PCR抑制剂的影响，使其在复杂样本(如血浆dd-cfDNA)检测中更具优势。
2.2 NGS检测法
NGS能够一次性地对大量的dd-cfDNA片段进行高通量测序，可全面检测cfDNA中体细胞单核苷酸变异、变异等位基因频率、拷贝数畸变或DNA甲基化模式等多种遗传变异信息。NGS通过分析供体和受体之间的多态性来区分dd-cfDNA和受体cfDNA，无需对供体和受体进行基因分型。
2.3 不同检测方法的定量标准
不同的检测方法使dd-cfDNA的定量标准也不同，利用NGS检测dd-cfDNA和受体cfDNA计算dd-cfDNA含量占总cf-DNA含量比例的结果表示为dd-cfDNA(%)；而利用数字PCR可以计算出每毫升血浆中dd-cfDNA片段的拷贝数(copies)，结果表示为dd-cfDNA(copies/mL)。有研究显示，当dd-cfDNA的值低于临界阈值时，有利于排除排斥反应，避免不必要的活检。
除PCR和NGS技术外，还有一些其他方法可用于dd-cfDNA检测。基于芯片的杂交捕获技术，通过设计与目标DNA序列互补的探针固定在芯片上，可对dd-cfDNA中的特定基因或基因区域进行捕获与检测，具有较高的特异度。此外，新兴的纳米测序技术也有望在未来dd-cfDNA检测中发挥重要作用，但目前基于纳米材料的dd-cfDNA分析仍处于早期阶段，其稳定性、灵敏度和特异度均有待进一步提高。
3 cfDNA在肾移植中的应用
3.1 器官移植的历史追溯
器官移植也是基因组移植，其中，肾移植术后，受者机体的免疫反应是一个持续且复杂的过程。随着时间的推移，移植物与受者之间的相互作用可能导致慢性排斥反应或其他免疫相关事件的发生，且伴随移植物细胞的损伤和死亡，从而释放更多的dd-cfDNA至血液循环中。肾移植术后发生排斥反应的患者血浆dd-cfDNA水平与未发生排斥反应的患者相比存在明显差异，这说明dd-cfDNA可用于评估移植肾排斥反应发生情况，当dd-cfDNA水平＜1%时提示未发生急性排斥反应，≥1%时说明可能发生急性排斥反应。有研究显示，肾移植术后5年内dd-cfDNA(%)呈现显著的时间依赖性增加。
3.2 抗体介导的排斥反应
在抗体介导的排斥反应(ABMR)中，补体系统被激活，对供体肾组织血管内皮细胞造成严重损伤，大量供体细胞内容物释放，dd-cfDNA水平升高。而在T细胞介导的排斥反应(TCMR)中，dd-cfDNA水平的升高幅度与肾小管间质炎症、血管内皮损伤等病理改变的程度密切相关。有研究显示，dd-cfDNA水平的升高与同种异体移植物排斥反应的发生、活动性和严重程度高度相关。dd-cfDNA在ABMR和TCMR中发挥的重要作用在大量的临床研究得到验证，有研究显示，血管紧张素1受体(AT1R)抗体介导的排斥反应、抗程序性死亡受体-1(PD-1)抑制剂诱导的排斥反应等。
据报道，不同排斥反应的dd-cfDNA水平临界阈值不同，在ABMR中，dd-cfDNA阈值约为2.45%，而在TCMR中则相对较低，约为1.3%，对于健康肾移植受者，其机体的dd-cfDNA水平通常维持在0.44%左右。不同状态下的dd-cfDNA水平阈值为临床诊断提供重要的参考依据。通过检测患者血液中dd-cfDNA水平并与相应的阈值进行比较，可以初步判断肾移植术后是否存在排斥反应或其他损伤情况。dd-cfDNA也可反映估算肾小球滤过率(eGFR)变化，eGFR与高水平的dd-cfDNA(≥0.5%)呈负相关。
DSA是引起同种异体移植排斥反应的重要原因。DSA能够激活补体系统，引发一系列炎症反应。补体系统的激活会导致移植物细胞的损伤和死亡，进一步加剧排斥反应。同时，炎症反应还会使免疫细胞浸润至移植物中，形成更多的免疫攻击，该过程对细胞造成损伤，使dd-cfDNA水平升高。
3.3 BK病毒相关肾病与肾移植的关系
BK病毒相关肾病(BKVAN)会导致移植肾功能丧失，约15%的肾移植患者会发生BK病毒血症，其中1%～10%患者发展为BKVAN，其组织学特征与移植后排斥反应类似。通过对10例肾移植术后发展为BK病毒血症或BKVAN患者所对应的dd-cfDNA进行检测分析，发现诊断为BK病毒血症患者的中位dd-cfDNA为0.58%，而BKVAN患者的中位dd-cfDNA为3.38%，该研究还发现dd-cfDNA水平与BK病毒载量呈正相关，并且对BKVAN的诊断敏感度为100%、特异度为50%。上述结果说明BKVAN患者的dd-cfDNA水平更高并且dd-cfDNA可以作为预测从BK病毒血症发展为BKVAN的生物标志物。
dd-cfDNA的半衰期较短，使其在移植后监测治疗效果方面具有良好效果。当排斥反应得到有效治疗后，受损的供体细胞不再持续释放dd-cfDNA，血液中的dd-cfDNA水平会迅速降低并趋于稳定。通过对接受抗排斥治疗的肾移植患者连续监测的临床研究显示，治疗后dd-cfDNA水平的降低速度和幅度与治疗效果呈正相关，炎症细胞的浸润与高水平的dd-cfDNA显著相关。这是因为当免疫系统中的巨噬细胞将移植物识别为异物时，可能会引起细胞凋亡。
此外，dd-cfDNA还可用于分析免疫抑制剂在肾移植中的疗效，他克莫司与dd-cfDNA之间存在负相关关系，可能是因为他克莫司会在肾移植术后早期破坏白细胞的稳定性，促进白细胞凋亡和溶解，血浆中总cf-DNA增加，而在移植后期随着他克莫司浓度的降低，白细胞凋亡减少，总cf-DNA和dd-cfDNA水平均降低，患者自身cf-DNA和总cf-DNA均减少，dd-cfDNA(%)增加。因此，动态监测dd-cfDNA水平可及时评估抗排斥治疗的有效性，指导临床调整免疫抑制剂的种类和剂量，避免过度免疫抑制导致感染等并发症或免疫抑制不足引起排斥反应复发。
除血液中的cfDNA，尿液中的cfDNA也逐渐成为肾移植研究的热点。有研究比较肾移植患者尿液dd-cfDNA的水平，发现术后急性排斥反应患者尿液的dd-cfDNA水平明显高于慢性移植物损伤患者和稳定患者，这提示尿液dd-cfDNA可以作为急性移植物损伤的标志物。与血液样本相比，尿液样本采集具有无创、方便、可多次重复采集等优点，更易于被患者接受。因此，尿液dd-cfDNA的研究为肾移植术后的无创监测开辟新的途径，通过定期检测尿液dd-cfDNA的变化，实现对肾移植患者的长期、动态监测，及时发现潜在的排斥反应或肾损伤风险。
4 总结与展望
器官移植是器官衰竭的有效治疗方法，而免疫抑制是影响移植物和患者生存的关键因素，免疫抑制不足会增加排斥反应和移植物损失，而过度的免疫抑制会导致机会性感染。近年来，dd-cfDNA在肾移植领域的研究取得显著的进展，作为一种无创诊断标志物，其为增强免疫抑制的个性化管理、改进移植后监测方法和移植损伤发生时的早期治疗干预提供重要依据。而尿液dd-cfDNA的研究、检测技术的不断改进与联合应用及甲基化分析的结合等方面的探索，进一步拓展dd-cfDNA在肾移植中的应用前景。
参考文献 略
本文仅供学习参考，完整准确内容请查阅原始文献：何昕阳,王耀,王海舰,等.供体来源的细胞游离DNA在肾移植中应用的研究进展[J].大医生,2025,10(9):129-133.
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